Оптическая микроскопия (стр. 9 )

Использование предметных стекол большей толщины может препятствовать

настройке освещения по Келеру. Особенно существенно использование тонких

высококачественных предметных стекол при работе по методу "темного поля"

Покровные стекла предназначены для предохранения микропрепаратов от пыли и

механических повреждений при микроскопировании. Покровные стекла, чаще всего имеют форму квадратных плоскопараллельных пластинок, размерами преимущественно 18x18 и 24x24 мм. Толщина покровного стекла не должна превышать 0,17мм

Объектив с коррекционной оправой

Особое значение толщина покровных стекол имеет при использовании сухих объективов

большого увеличения (40х).

Ø  Покровные стекла нестандартной толщины могут быть использованы только с сухими объективами, имеющими коррекционную оправу, на которой указана толщина покровного стекла.

Ø  Для иммерсионных объективов, толщина покровного стекла не имеет существенного значения. Однако, использование покровных стекол большей толщины, чем рабочее расстояние объектива, может явиться препятствием для получения четкого изображения препарата из-за невозможности сфокусировать объектив на препарат. Кроме того, при безуспешной попытке сфокусировать объектив может быть повреждена его фронтальная линза

Препарат для микроскопии, предназначенный для длительного хранения

Для улучшения качества изображения, и в случае необходимости хранения препаратов,

между покровным и предметным стеклами могут быть помещены различные заключающие

среды с более высоким, чем у воздуха, показателем преломления.

Ø  К средам для кратковременного хранения и наблюдения препаратов относятся: вода и водные растворы, глицерин, спирты и т. п.(препараты типа "раздавленная капля"). Для уменьшения испарения жидкости эти препараты окантовываются по краям покровного стекла расплавленной смесью воска с парафином, маслом, клеем и др.

Ø  В качестве сред для длительного хранения препаратов используют канадский бальзам, синтетические смолы (поливиниловый спирт, полистирол и т. п.)

Фотомикроскопия

фотомикроскопия позволяет вводить микроскопическое изображение в память компьютера, производить измерения размеров объектов(морфометрия) и их оптических характеристик(денситометрия)

Системы анализа изображений

системы анализа изображения состоят из микроскопа, средств ввода и оцифровки изображения, персонального компьютера и программного обеспечения, основные области применения систем анализа изображений в микроскопии - это научные исследования, объективизация диагностики, уменьшение рутинных работ (например анализ клеточного состава мазка крови), формирование автоматизированных рабочих мест специалистов (морфолг, гематолог и др.)

системы ввода изображения позволяют наблюдать на экране монитора изображение микроскопических объектов, одновременно с визуальным наблюдением их в микроскопе. При этом монитор может быть установлен на значительном расстоянии от микроскопа. Это позволяет использовать телевизионную микроскопию для целей обучения и для консультации со специалистами. Большое значение имеет ввод микроскопических изображений в компьютер для архивации, анализа, создания обучающих пособий

Погрешности изображения, получаемого с помощью оптики.

Изображение, получаемое с помощью отдельной линзы, не является совершенным - оно
обладает целым рядом дефектов. Поэтому, в оптике микроскопа используют комбинацию
различных линз, которые позволяют компенсировать эти недостатки. К таким погрешностям
линз и, в частности, микроскопической оптики относятся сферическая абберация,
хроматическая абберация, кривизна поля изображения и др.

Сферическая абберация связана с тем, что лучи проходящие через центральный участок линзы, проделывают в стекле более длинный: путь, чем лучи проходящие через периферический участок, поэтому фокусируется в разных плоскостях, что приводит к нерезкости изображения.

Хроматическая аберрация связана со способностью линзы различно преломлять составляющие белый свет лучи различных участков спектра.

Кривизна поля изображения выражается в невозможности одновременно сфокусировать центральный и периферический участки поля зрения.

Помимо указанных погрешностей существуют и другие (например кома, астигматизм), которые здесь не рассматриваются. Сферическая абберация приводит к нерезкости изображения, поскольку лучи, проходящие через центр и периферию линзы фокусируется в разных плоскостях. Хроматическая аберрация особенно ухудшает качество изображения при наблюдении окрашенных препаратов, кривизна поля препятствует получению хорошей микрофотографии. Эти погрешности устраняются путем подбора комбинации линз с различной кривизной поверхности, с разной преломляющей способностью, изготовленных из различного сорта оптического стекла.

На рисунках 3, 4 показаны два вида хроматической абберации:

хроматическая аберрация положения (рис.3) при которой изображения, образованные лучами разных участков спектра фокусируются в разных плоскостях, и

хроматическая аберрация увеличения (рис.4), при которой эти изображения имеют разную величину, что ведет к образованию цветных ободков вокруг деталей изображения.

Рис. 5 Исправление хроматической аберрации

На рис.5 показано частичное исправление хроматической аберрации путем комбинации

Инвертированный микроскоп.

Методы наблюдения в проходящем и отраженном свете,

Метод фазового контраста,

Метод темного поля;

Области применения.

Флуоресцентные микроскопы

Устройство и принципиальные особенности эпи-флуоресцентного микроскопа Устройство и принципиальные особенности конфокального сканирующего микрос

Области применения флуоресцентных микроскопов.

Спектральные флуоресцентный и КР - микроскопы: устройство и применение. Двухфотонная флуоресцентная микроскопия: принцип, особенности и применение.

с

Биологические объекты исследования методами микроскопии.

Пространственное и спектральное разрешение.

Микроскопия единичных молекул.

Флуорофоры и их характеристики, существенные для микроскопии.

Метод FRAP (восстановление флуоресценции после фотовыгорания )

Метод FRET (флуоресцентный резонансный перенос энергии).

Собственные клеточные флуорофоры.

Флуоресцирующие биологически-активные соединения и их изучение методами оптической микроскопии.

Флуоресцентные зонды и их применение в микроскопии.

Флуоресцентные метки: выбор: процедура и особенности мечения: применение.

Литература.

1.  Введение в методы микроскопического исследования, М.,1959

2.  Основы теории микроскопа, М., 1955

3.  , Андреев микроскопов, Л.,1976

4.  Пешков и основные методы работы с ним. В кн. "Лабораторные
методы исследования патогенных простейших", М., 1957, стр. 7-51

5.  Световая микроскопия в биологии. Методы. Под ред. А. Лейси, М., 1992

6.  , , Федин , 1969

В интернете: http://www. diamorph. ru

Лит.: , Люминесцентная микроскопия, «Вестник АН СССР», 1953, № 10, с. 3—10; Микроскопическая техника, пер. с нем., М., 1954; , О флуоресцентных микроскопах, «Журнал общей биологии», 1955, т. 16, № 3, с. 222—37; Современные методы и техника морфологических исследований. [Сб. ст.], под. ред. , Л., 1955; , , Микроскопическая техника, 3 изд., М., 1957; Введение в методы микроскопического исследования, пер. с нем., М., 1959; , Метод люминесцентной микроскопии в микробиологии, вирусологии и иммунологии, Л., 1964.

Лит.: Руководство по цитологии, т. 1—2 М. — Л., 1965-66.,

Лит.: Основы теории микроскопа, пер. с нем., М., 1955; Оптические исследования при помощи поляризационного микроскопа, пер. с нем., М., 1937; Микроскопы, под ред. , М., 1969; , Теория оптических приборов, 2 изд., ч. 1—2, М. — Л., 1948—52; Фазово-контрастный и интерференционный микроскопы, пер. с франц., М., 1960; , Микроскопы, принадлежности к ним и лупы, М., 1961; , , Микрофотография, Л., 1971; Оптические приборы для измерения линейных и угловых величин в машиностроении, М., 1964.

.

, . Телевизионная измерительная микроскопия. - Саратов : Изд-во Сарат. ун-та, 1996.

Multidimensional microscopy / Cheng Р. С. et al. ed. - New York etc. : Springer, Cop. 1994.

Corle Timothy R., Kino Gordon S. Confocal scanning optical microscopy and related imaging systems. - San Diego (Calif.) etc. : Acad. press, 1996.

Scanning probe microscopy and spectroscopy : Theory, techniques, a. applications / Bonnell Dawn A. - 2d ed. - New York etc. : Wiley-VCH, Cop. 2001.

Methods in enzymology. Vol. 307 : Confocal microscopy / Conn P. Michael. - Cop. 1999. - XXXII.

"Principles of Fluorescence Spectroscopy (2-nd edition)." J. R. Lakowicz, Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York, NY, 1999.

"Protein Localization by Fluorescence Microscopy: A practical approach." V. J. Allan, Oxford University Press, Oxford, England, 2000.

Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) - A technique in light microscopy using a pulse from a focused laser microbeam to deplete the fluorescence in a local region in a living cell The subsequent recovery of fluorescence in the irradiated region is measured to establish the mobility of the molecules that carry the fluorescent tag.