Методический материал по медицинской биотехнологии для студентов лечебного дела 2курса. «Препараты на основе рекомбинантных белков и пептидов» (стр. 5 )

3. Сыворотки могут быть использованы и для диагностических целей, для создания различных диагностических наборов ( например в тестах на определение беременности). В этом случае антитела используются в реакциях образования комплексов с антигенами (антиген (АГ) – антитело (АТ), когда происходит подтверждение наличия соответствующих антигенов, что может быть использовано в различных реакциях.

Профилактическое или лечебное действие сывороток основано на содержащихся в сыворотке антителах (АТ)

Для массового получения сыворотки вакцинируют ослов, лошадей. Введение

такой сыворотки дает образование пассивного иммунитета, то есть организм

получает готовые антитела. Сыворотки, которые получают путем иммунизации животных должны быть на контроле по такому показателю, как титр антител у животных, чтобы брать у них кровь в период максимального содержания антител. Из крови животных выделяют плазму крови, затем из плазмы удаляют фибрин и получают сыворотку. Это один способ получения сыворотки.

Другой способ получения сыворотки – это из культивируемых животных клеток.

Цитокины, как основа для получения новых лекарственных средств

Одним из важнейших путей усовершенствования лекарственных средств является использование новых ранее неиспользуемых (или неизвестных) групп биологически активных веществ. К числу таких веществ, безусловно, относятся различные цитокины. Следует отметить, что попытки использования генно-инженерных цитокинов в клинической практике продолжаются уже в течение последних 10-15 лет.

Цитокины представляют собой пептиды или гликопротеиды с молекулярной массой от 6 до 60 кДа. Они действуют как гуморальные регуляторы в пикомолярных и наномолярных концентрациях, модулируя при нормальных или патологических состояниях организма функциональную активность индивидуальных клеток и тканей. Основное отличие цитокинов от пептидных гормонов состоит в том, что они не продуцируются клетками, либо собранных в специализированную железу. Кроме того, спектр действия цитокинов гораздо шире, чем у пептидных гормонов, так как они взаимодействуют с большим числом различных клеток, не проявляя при этом антигенной специфичности. К наиболее важным биологическим свойствам цитокинов относят:

- индуцибельность - продукция цитокинов осуществляется в ответ на действие стимулирующих факторов;

- локальность действия;

- избыточность – каждый тип клеток может вырабатывать несколько цитокинов, а каждый цитокин может продуцироваться несколькими типами клеток;

- взаимосвязь и взаимодействие – одни цитокины могут индуцировать выработку других или повышать экспрессию соответствующих рецепторов.

Четкой классификации пока не выработано, но по преобладающей направленности действия выделяют следующие группы:

- интерлейкины, участвующие в процессах взаимодействия лейкоцитов;

- интерфероны, обладающие противовирусной активностью;

- факторы некроза опухолей;

- колониестимулирующие факторы – гемопоэтические цитокины, действующие на кроветворные клетки, начиная с уровня стволовых;

- хемокины – хемотаксические цитокины, участвующие в иммунных и воспалительных реакциях;

- факторы роста, модулирующие рост и дифференцировку клеток.

К последней группе относится семейство ЭФР, в которое кроме него самого входят: a-трансформирующий фактор роста (a-TGF); фактор роста вируса осповакцины (VGF); амфирегулин – фактор роста из клеток шванномы (SDGF); гепаринсвязывающий ЭФР-подобный фактор (HB-EGF); новый дифференцирующий фактор (NDF); хиригулины. Ростовые факторы обладают аминокислотной гомологией внутри последовательности из 35-40 аминокислот, включая положение шести консервативных цистеинов и формируемые ими три дисульфидные связи. Они взаимодействуют с одним и тем же рецептором (ЭФРР) на поверхности цитоплазматической мембраны клеток (ErbB-рецептор), обладающим киназной активностью. В настоящее время структура рецептора и процессы взаимодействия ЭФР и его гомологов с ним достаточно хорошо изучены. Многие патологические и нормальные процессы в организме обусловлены изменениями в системе ЭФР-ЭФРР.

ЭФР – полипептид с молекулярной массой около 6 кДа играет важную роль в клеточных коммуникационных процессах. Он стимулирует пролиферацию и дифференцировку различных типов клеток. Это свидетельствует о возможности использования цитокина в качестве лекарственного средства для лечения целого ряда патологий. По-видимому, наиболее близки к практической реализации работы, направленные на применение ЭФР для лечения ран кожи, ожогов, трофических язв. Следует отметить, что для этих целей чаще всего используют АПЛС матричного типа, содержащие в качестве матрицы коллаген или другие раневые покрытия. При этом важными факторами, влияющими на успех лечения, являлись состав матрицы, ее геометрические параметры, концентрация цитокина. Обнаружено значительное ускорение заживления роговицы глаз после ее хирургического повреждения у кроликов при применении глазных капель с ЭФР. Кроме того, данные о содержании ЭФР и его рецептора активно используется для разработки диагностических тестов.

Несмотря на явную перспективность использования цитокинов в качестве лекарственных средств, необходимо отметить, что они до сих пор не вошли в широкую медицинскую практику. Существуют, по-видимому, две основных причины объясняющие подобное положение. Первая причина заключается в крайне низком содержании цитокинов в биологических жидкостях и тканях, что делает нерентабельным их получение из этих источников. Вторая причина - относительно большая молекулярная масса, которая не позволяет использовать для этих целей методы химического синтеза. В настоящее время единственным, реальным источником получения цитокинов являются рекомбинантные штаммы микроорганизмов (Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Bacillus brevis, Pichia pastoris, Pseudomonas pseudaflava).

Рекомбинантные (химерные) ДНК

Создаваемые генными инженерами рекомбинантные ДНК называют химерными. Они были созданы для самых разнообразных целей, в том числе и для целенаправленного воздействия на ВИЧ. В последние годы число научных работ в этом направлении очень велико ( рис. 35 ).

Одна из испытанных схем с использованием химерных ДНК заключалась в следующем ( рис. 35А ). К гену, кодирующему белок-рецептор CD4 , "подшили" другой ген, который обеспечивает синтез растительного белка рицина . Рицин еще в средние века использовался в качестве сильнейшего яда. Попадая в клетку, он блокирует синтез белка в цитоплазме, тем самым убивая ее. После внесения в клетки такой рекомбинантной ДНК в конечном итоге происходит образование кодируемого ей химерного белка. Та его часть, которая соответствует белку-рецептору, обеспечивает строго специфическое связывание химеры с клетками, на поверхности которых содержится вирусный белок CD4. Другая же представляет собой яд рицин и уничтожает клетки, с которыми связывается химерная молекула. Таким образом, одна часть химеры обеспечивает направленный поиск в организме клеток, зараженных вирусом, а другая ее часть убивает их. Схема довольно проста и эффективна. В качестве "убийцы" можно использовать не только ген рицина, но и некоторые другие гены.

Другой подход к борьбе с ВИЧ-инфекцией основан на способности некоторых вирусных белков ( Tat и Rev ), чрезвычайно важных для размножения ВИЧ в клетках, специфически связываться с определенными участками молекулы вирусной РНК ( рис. 35Б ). Для того, чтобы предотвратить этот жизненно важный процесс, было предложено вводить в инфицированные клетки искусственно синтезированные РНК, содержащие участки связывания с вирусными белками. Вирусному белку все равно, с чем связываться - с вирусной РНК или точно такой же "копией", сконструированной искусствено. Добавленная в клетку в большом количестве, "копия" играет в данном случае роль "ловушки": если ее много, белок вируса будет связываться преимущественно с ней, а не с РНК вируса, и, в результате этого, ВИЧ перестанет размножаться.

Теоретически описанные подходы выглядят очень привлекательно. И, как показали проведенные испытания, в изолированных клетках они работают очень хорошо. Однако нет надежных способов доставки и обеспечения долгого функционирования химерных "конструктов" в целом организме.

Указанные трудности ученые пытаются преодолеть с помощью тех же вирусов. Недавно опубликовано сообщение об успешном использовании для противодействия ВИЧ вируса бешенства. Естественно, это был не вирус сам по себе, а его вариант, который не способен приводить к заболеванию. К такому варианту был "пришит" ген белка CD4. В остальном схема была та же, что и в случае с рицином. Связываясь только с ВИЧ-инфицированными клетками, рекомбинантный вирус их уничтожал, другие же клетки оставались неизменными. Возможно, такой путь окажется эффективным в будущем.

Недавно появилось сообщение о создание еще одной "химеры" против ВИЧ на основе антиретровирусного препарата энфервиртид.

Энфервиртид представляет собой короткий фрагмент белка gp41 ВИЧ , который, несмотря на то, что он вроде как "родной", препятствует вирусу "сливаться" с клеткой. На основе ретровируса мышей сконструировали химерный вирус, который способен в клетках человека производить такой короткий фрагмент белка ВИЧ и "выставлять" его на поверхности клеток, зараженных химерным вирусом. В результате ВИЧ не может проникать в клетки даже при наличии в них всех рецепторов и корецепторов. Таким образом, фрагмент вирусного белка выступает в качестве "щита" против целого вируса. Очень важно, что защита срабатывает на самом начальном этапе инфицирования клетки. Ведь когда вирус уже проник в нее, с ним бороться практически невозможно. Начатые в клинике испытания новой "химеры", по утверждению исследователей, дали очень обнадеживающие результаты.

Рис. 35 spid Химерные ДНК для подавления ВИЧ-инфекции

Варианты использования генными терапевтами химерных ДНК для подавления ВИЧ-инфекции многообразны. На рисунке приведены некоторые из них, уже успешно опробованные на клеточных моделях. А - Химерный белок, одной частью которого является растительный белок-яд рицин, а другой белок - рецептор CD4, за счет рецептора специфически взаимодействует только с теми клетками, на поверхности которых "торчит" вирусный белок gp120. В результате этого рицин, содержащийся в химерном белке, специфически убивает инфицированные клетки. Б - Подавление размножения ВИЧ достигается за счет "конкуренции" за связывание с регуляторным вирусным белком (Tat или Rev) между вирусной РНК и искусственными РНК-ловушками. Последние, в силу своей многочисленности, притягивают к себе большую часть регуляторного белка. Для РНК ВИЧ наступает дефицит соответствующего регуляторного белка. В условиях такого дефицита вирусная РНК не способна обеспечить продуктами полноценный цикл развития вируса.

Бесклеточные белоксинтезирующие системы: общие сведения

Среди искусственных систем биосинтеза белка важное место занимают бесклеточные системы. Бесклеточные системы создаются для моделирования биохимических процессов, происходящих в живом организме, и воспроизводят некоторые особенности жизнедеятельности клетки. В генной инженерии бесклеточные белоксинтезирующие системы используются для исследования кодирующего потенциала и механизмов экспрессии клонированных генов in vitro, и на промежуточных этапах конструирования рекомбинантных генов для идентификации мРНК или фрагментов ДНК по кодируемым белкам.

Преимуществом бесклеточных систем перед клетками является доступность их компонентов для экспериментальных воздействий. Такие системы позволяют исследовать влияние различных экзогенных факторов на их функционирование (ионные условия, рН, ингибиторы и активаторы и т. п). В бесклеточной системе можно заменять отдельные компоненты или непосредственно воздействовать на них в изолированном состоянии и затем по реакции системы познавать их функциональную значимость. Большинство результатов, полученных с помощью бесклеточных систем, невозможно было бы получить при использовании живых клеток, погибающих при нарушении гомеостаза. Достоинства бесклеточных систем одновременно являются их слабым местом, поскольку после разрушения клеток исчезают многочисленные взаимодействия между их компонентами, благодаря которым можно отличить живую клетку от бесклеточного экстракта.

Бесклеточные белоксинтезирующие системы представляют собой одни из самых сложных и многокомпонентных систем in vitro, используемых в биохимии. Это связано с необходимостью воспроизведения в пробирке всех этапов биосинтеза белка, включая транскрипцию, аминоацилирование тРНК и трансляцию мРНК рибосомами. Тем не менее удается успешно осуществлять процесс биосинтеза белка in vitro и использовать такие системы по трем основным направлениям: для анализа кодирующего потенциала нуклеиновых кислот, исследования механизмов биосинтеза белка и препаративной наработки некоторых рекомбинантных белков и пептидов.

По природе компонентов, которые определяют способность бесклеточных систем осуществлять трансляцию определенных мРНК, принято различать прокариотические и эукариотические системы . Наиболее эффективная трансляция мРНК происходит в гомологичных бесклеточных системах. Под контролем гомологичных регуляторных элементов в бесклеточных системах могут быть успешно транслированы и чужеродные мРНК - транскрипты рекомбинантных генов.

В некоторых бесклеточных системах транслируют предварительно очищенную мРНК или используют эндогенную мРНК, присутствующую в полисомах. В других белоксинтезирующих системах - системах сопряженной транскрипции и трансляции, одновременно происходят синтез мРНК и ее трансляция рибосомами.

Из-за высокой стоимости очищенных компонентов в подавляющем большинстве случаев бесклеточные системы биосинтеза белка используют в аналитическом варианте, когда объем пробы не превышает 100 мкл. Разработаны проточные белоксинтезирующие системы , в которых процесс трансляции удается поддерживать длительное время, непрерывно подводя извне расходуемые вещества, с одновременным удалением синтезируемых белков и продуктов деградации компонентов системы.

Проточные системы синтеза белка

В лаборатории в 1988 г. удалось получить эффективную бесклеточную белоксинтезирующую систему. В их модификации бесклеточные экстракты бактериальных или эукариотических клеток помещают в ячейку, закрытую с двух сторон полупроницаемыми мембранами. Размер пор позволяет проходить через мембраны вместе с током жидкости низкомолекулярным химическим веществам и небольшим белкам. Ячейку с компонентами для бесклеточной трансляции инкубируют при обычной температуре. С одной стороны в ячейку-реактор со скоростью примерно 1 мл/ч непрерывно поступают ингредиенты, расходуемые в процессе биосинтеза белка (аминокислоты, АТР, GTP), с другой стороны выходят синтезированные белковые продукты (если их молекулярная масса и отсутствие способности к агрегации позволяют пройти через поры мембраны).

Биосинтез белка в проточной системе может продолжаться непрерывно в течение нескольких десятков часов, причем на одну молекулу транслируемой мРНК синтезируются сотни копий полипептидных цепей белков, суммарный выход которых может достигать 200 мкг и более на 1 мл бесклеточного экстракта.

С разработкой проточной бесклеточной белоксинтезирующей системы стало возможным проводить биосинтез рекомбинантных белков в препаративных количествах in vitro. Такая система позволяет синтезировать в больших количествах полипептиды, подверженные быстрой внутриклеточной деградации протеиназами или образующие тельца включения в живых клетках. Проточная система может быть полезна для получения белков, обладающих цитотоксической активностью, или других рекомбинантных полипептидов, для которых нежелательны артефактные посттрансляционные модификации, происходящие in vivo. В таких системах удалось получить препаративные количества функционально активного интерлейкина 6 человека.