Методический материал по медицинской биотехнологии для студентов лечебного дела 2курса. «Препараты на основе рекомбинантных белков и пептидов» (стр. 1 )

Методический материал по медицинской биотехнологии для студентов Лечебного дела 2курса.

«Препараты на основе рекомбинантных белков и пептидов»

Генная инженерия — совокупность приёмов, методов и технологий получения рекомбинантных РНК и ДНК, выделения генов из организма (клеток), осуществления манипуляций с генами и введения их в другие организмы. Генная инженерия служит для получения желаемых качеств изменяемого организма.

В отличие от традиционной селекции, в ходе которой генотип подвергается изменениям лишь косвенно, генная инженерия позволяет непосредственно вмешиваться в генетический аппарат, применяя технику молекулярного клонирования.

Красная биотехнология (red biotechnology) [греч. bios — жизнь, techne — искусство, мастерство и logos — учение] — использование биотехнологических процессов и методов в медицине, напр. в создании биофармацевтических препаратов (белков, ферментов, антител), а также в генной и клеточной терапии. Термин «К. б.» предложен в 2003 г. на Всемирном форуме по биологическим наукам.

Биообъекты, в которые путем генно-инженерных манипуляций введена чужеродная ДНК, ответственная за синтез чужеродного или гетерологичного продукта, носят название рекомбинантных. Синтезируемые этими биообъектами чужеродные вещества также называют рекомбинантными. Если речь идет о белках или пептидах, то их соответственно называют рекомбинантными белками и пептидами.

Белковая инженерия (protein engineering) [франц. ingenier — инженер, от лат. ingenium — способность, изобретательность] — совокупность генно-инженерных и биохимических методов, с помощью которых создают рекомбинантные белки и осуществляют модификацию физико-химических или биологических свойств природных белков с целью улучшения их качества, замены отдельных аминокислот или комбинирование крупных блоков полипептидных цепей (доменов) разных белков. Используются в биотехнологии для создания белков с новыми свойствами. Примером методов, используемых в Б. и., является мутагенез in vitro, позволяющий изменять кодирующую способность гена в определенном месте (напр., в пределах области, кодирующей активный центр белка).

В настоящее время на базе любых микро-биообъектов можно получать рекомбинантные производные. Однако обычно самым распространенным является получение рекомбинантных микроорганизмов. К микроорганизмам, которые для этих целей используются чаще всего, относятся:

·  Escherichia coli,

·  Bacillus spp.,

·  Erwinia spp.,

·  Pseudomonas spp.,

·  Rhizobium spp.,

·  Saccharomyces cerevisiae и другие.

Для того, чтобы микроорганизмы можно было использовать в качестве генетически модифицированных продуцентов лекарственных средств, они должны удовлетворять некоторым обязательным требованиям.

1.Микроорганизм-реципиент не должен обладать патогенностью и токсигенностью.

2.Безопасность генно-инжененрных производных.

3.Быстро размножающиеся штаммы.

4.Желателен рост на простых питательных средах.

5.Возможность образования суспензий высокой плотности.

Генетические векторы. Сегмент ДНК (ген), который предназначен для молекулярного клонирования, должен обладать способностью к репликации при переносе его в бактериальную клетку, т. е. быть репликоном. Однако он такой способностью не обладает. Поэтому, чтобы обеспечить перенос и обнаружение клонируемых генов в клетках, их объединяют с так называемыми генетическими векторами.

В качестве таких носителей можно использовать:

1)плазмиды;

2)различные типы бактериофагов

3) вирусные векторы

5)многообразие сверхъемких векторов (так называемых «искусственно созданных» хромасом (AC – artificial chromosomes)

YAC Yeast Artificial Chromosomes – дрожжевые искуственно созданные хромосомы	BAC Bacterial Artificial Chromosomes – искусственные хромосомы бактерий	PAC-P1 Phaqe-derived Artificial Chromosomes – искусственно полученные мини-хромосомы бактериофагов,
и «сверхдлинные»:
МАС Mammilian Artificial Chromosomes – искусственные хромосомы животных	HAC Human Artificial Chromosomes – искусственно полученные хромосомы человека

Создание последних двух типов АС было инициировано исследованиями генов в хромосомах высших органов: растений, животных, человека, в том числе и полное секвенирование их геномов (длина отдельных исследуемых фрагментов ДНК достигает нескольких сотен тысяч пар оснований, а длина одной из типичныхт хромосом человека составляет 100-200 миллионов пар оснований).

Наиболее распространённым типом носителей необходимой информации – векторами в генной инженерии являются рекомбинантные плазмиды, содержащие целевые гены и представляющие собой кольцевые, ковалентно замкнутые двухцепочечные молекулы. Цепи ДНК в этих молекулах составляют от 2000 до 200000 тысяч пар нуклеотидов – т. п.н. (или тысяч пар оснований – т. п.о.). Эти внехромосомные генетические элементы встречаются во множестве бактериальных систем. Они способны автономно реплицироваться в них, что сопряжено с участком – origin of replication (ori). Представленные в достаточном количестве копии плазмид (их количество колеблется от одной до десятков и даже сотен) достаточно легко отделить от более значительных по размеру хромосомных и ядерных клеточных ДНК. Они должны нести один или несколько маркерных участков (с помощью маркеров легко выявлять клетки, внутри которых находятся эти векторные молекулы). И наконец, плазмиды должны содержать единичный уникальный сайт. Сайт – это небольшой участок ДНК длиной от 4 до 10 пар нуклеотидов (п. н. или п. о.) – для одного фермента рестрикции (или несколько сайтов для нескольких ферментов-эндонуклеаз рестрикции).

Плазмидные векторы удобны для клонирования относительно небольших фрагментов (до 10 тыс. пар оснований) геномов небольших размеров. Если же требуется получить клонотеку (или библиотеку) генов высших растений и животных, общая длина генома которых достигает огромных размеров, то обычные плазмидные векторы для этих целей непригодны. Проблему создания библиотек генов для высших эукариот удалось решить с использованием в качестве клонирующих векторов производных бактериофага l. Эти векторы конструируются из реплекативной (двутяжевой) формы ДНК фага М13, в которую встроены "полилинкерные" участки (пример такой конструкции показан на рис. 2). В фаговую частицу ДНК включается в виде однотяжевой молекулы. Таким образом, этот вектор позволяет получать клонированный ген или его фрагмент как в двутяжевой, так и в однотяжевой форме.

Перенос чужеродных генов в клетки животных осуществляется с помощью векторов, полученных из ДНК ряда хорошо изученных вирусов животных - SV40, некоторых аденовирусов, вируса папиломы быка, вируса оспы и так далее. Конструирование этих векторов проводится по стандартной схеме: удаление "лишних" сайтов для рестриктаз, введение маркерных генов в области ДНК, не существенные для ее репликации (например, гена тимидин-киназы (tk) из HSV (вируса герпеса)), введение регуляторных районов, повышающих уровень экспрессии генов.

Удобными оказались так называемые "челночные векторы", способные реплицироваться как в клетках животных, так и в клетках бактерий. Их получают, сшивая друг с другом большие сегменты векторов животных и бактерий (например, SV40 и pBR322) так, чтобы районы, ответственные за репликацию ДНК, остались незатронутыми. Это позволяет проводить основные операции по конструированию вектора в бактериальной клетке (что технически намного проще), а затем полученную рекомбинантную ДНК использовать для клонирования генов в животной клетке.

Рисунок 2. Рестрикционная карта вектора М13 mp8.

Существуют гибридные вектора. К ним относятся, например:

Космиды – плазмидные вектора, в которые встроен участок генома фага λ, обеспечивающий возможность упаковки этой молекулы ДНК в фаговую частицу. Фаговые частицы обеспечивают хорошее проникновение гибридной ДНК в клетку (путем инъекции), после чего происходит замыкание ДНК в кольцо по липким концам и репликация ее по плазмидному типу.

Фазмиды также являются гибридами между фагом и плазмидой. После встройки чужеродной ДНК могут в одних условиях развиваться как фаги, в других – как плазмиды.

Фагмиды - векторы содержащие элементы вирусной нуклеиновой кислоты и плазмиды, что дает им возможность в определенных условиях образовывать зрелые фаговые частицы или существовать в бактериальных клетках в виде плазмид.

Создание новых плазмидных векторов

1 этап –Рестрикция – связан с обработкой эндонуклеазой рестрикции какого-то известного источника ДНК – возможно этим объектом будет какая-то уже известная плазмидная конструкция. Желательно, чтобы этот объект подвергся гидролизу в одном месте (сайте рестрикции), какой-либо рестриктазой.

Рестриктаза – это эндонуклеаза, узнающая какую-то последовательность внутри цепи ДНК (сайт рестрикции, см. выше) и проводящая гидролиз (разрыв) этой цепи. Сейчас насчитывается 5 классов этих ферментов.

Рестриктазы впервые были выделены из Е. coli в 1968 г. Оказалось, что они способны разрезать (плавить) молекулы ДНК на разных сайтах (местах) рестрикции. Эти ферменты получили название эндонуклеаз класса I. Затем у бактерий были обнаружены эндонуклеазы класса II, которые распознают в чужеродной ДНК сайты рестрикции специфически и на этих сайтах тоже осуществляют рестрикцию. Именно ферменты этого класса стали использовать в генной инженерии. Тогда же были открыты ферменты класса III, которые плавят ДНК рядом с сайтами распознания, но эти ферменты не имеют значения в генной инженерии.

В настоящее время используется свыше 400 различных рестриктаз. Эти ферменты синтезируют самые разнообразные микроорганизмы. Название фермента отражает название микроорганизма, из которого его выделяют.