Методы изучения генетики человека (стр. 4 )

Культивирование клеток. Образец помещают в питательную солевую среду с добавлением цельной сыворотки крупного рогатого скота и белка бобовых растений – фитогемагглютинина, стимулирующего процесс деления клеток. Кариотип изучают в метафазных клетках, где хромосомы достигают наибольшей спирализации и наиболее четко проявляется их форма. Для увеличения числа метафазных клеток за 1,5 часа до окончания культивирования в культуру вводят колхицин (C22H25NO6) или его химический аналог колцемид, которые разрушают клеточное веретено, приостанавливают деление клеток на стадии метафазы и увеличивают конденсацию хромосом. Обычно культивирование составляет 72 часа. После этого клетки отделяют центрифугированием и помещают в гипотонический раствор хлорида калия или цитрата натрия, в котором происходит разрыв ядерной оболочки и межхромосомных связей и хромосомы свободно перемещаются в цитоплазму. Затем клетки фиксируют в фиксаторе измененный Карнуа 3:1, (3 части 96% этиловый спирта ректификата и 1 часть ледяной уксусной кислоты).

После фиксации клеточную суспензию раскладывают на обезжиренные, охлажденные влажные предметные стекла и высушивают на воздухе.

Окраска препарата. Наиболее простой метод окраски хромосом, его называют рутинным – это сплошная, по Гимза. Метод применяется для определения количества хромосом, выявления геномных мутаций и анеуплоидии. Для выявления хромосомных мутаций используют дифференциальную окраску, в результате которой хромосомы приобретают поперечную исчерченность. Расположение и длина темных и светлых полос строго индивидуальна для каждой хромосомы, благодаря этому можно провести более точную идентификацию гомологичных пар и выявить перестройки хромосом.

Для дифокраски используют G-метод, C-метод, R-метод, T-метод и Q-метод. Для окраски хромосом можно использовать флуорохромы: акрихин, акрихин-иприт, квинакрин и др. В результате дифференциальной флуоресцентной окраски идентифицируют каждую пару гомологичных хромосом и определяют наличие Y-хромосомы в интерфазном ядре по свечению Y-хроматина. Наиболее эффективен G-метод с использованием красителя Гимза после предварительной обработки хромосом раствором трипсина, при котором количество полос на хромосомах в метафазных пластинках достигает 400. После окраски объект заключают в Канадский бальзам, препарат становится постоянным и может храниться десятки лет.

Микроскопический анализ метафазных хромосом. Световое микроскопирование фиксированных и окрашенных препаратов позволяет визуально наблюдать хромосомы. Наиболее подходящие метафазные пластинки фотографируют, получают фотографии и обрабатывают их: составляют кариограммы, в которых хромосомы выстроены парами и распределены по группам, устанавливают общее число хромосом и выявляют изменение их количества и структуры в отдельных парах. Для кариотипирования подбирают метафазные пластинки в количестве не менее 30, с одинаковым индексом спирализации.

В случае мозаицизма по хромосомным аномалиям количество изучаемых хромосом увеличивают, вычисляя количество клеток, необходимых для анализа по формуле Р = (1 – р)n, где р – заданный уровень мозаицизма, Р – вероятность обнаружения мозаицизма. Для выявления мозаицизма анализируют несколько тканей, например, клеток крови, фибробласов и половых желез.

Принципы описания кариотипа человека. Для описания кариотипа человека используется универсальная схема и специальные символы. Например, запись 46,ХХ – обозначает нормальный кариотип женщины, а 46,XY – нормальный кариотип мужчины. При изучении хромосом обнаруживают полиморфизм, который наиболее характерен для акроцентрических хромосом и, как правило, отражает вариабельность размеров гетерохроматиновых сегментов, наличие спутников, спутничных нитей в области коротких плеч и их величину, в табл. 2 приведены некоторые из них.

Установлено, что наличие нормального полиморфизма хромосом увеличивает риск рождения ребенка с хромосомными аномалиями.

Таблица 2

Обозначение полиморфизма хромосом человека. (Из: , 2006)

Символы кариотипа	Тип хромосомной перестройки
46,ХХ,9qh+	Увеличение размера гетерохроматинового участка в длинном плече хромосомы 9 женщины
46,XY, Yqh-	Уменьшение размера гетерохроматинового района на длинном плече Y хромосомы у мужчины
46,XX,22ps+	Увеличение размера спутников на коротком плече хромосомы 22 у женщины
46,XY,21pstk	Увеличение длины спутничных нитей на коротком плече хромосомы 21 у мужчины
46,XX, fra(16)(q21.3)	Ломкий сайт в сегменте 21 длинного плеча хромосомы 16
46,XX,15pss	Появление двойных спутников на коротком плече хромосомы 15 у женщины
46,XX,21ps+	Увеличение размера спутников на коротком плече хромосомы 21 у женщины

Среди супружеских пар, у которых наблюдалось рождение детей с пороками развития, а также страдающих бесплодием и привычным невынашиванием беременности, чаще выявляется носительство хромосом с крупными гетерохроматиновыми блоками. Преобладание лиц с увеличенными гетерохроматиновыми сегментами в акроцентрических хромосомах, а также в хромосомах 1, 9 и 16 отмечено в группе детей с множественными врожденными пороками развития.

Следуя рекомендациям IV Международного конгресса по генетике человека в Париже (1971), при описании добавочных хромосом их номер помещают после общего числа аутосом и половых хромосом со знаком «плюс» или «минус» перед номером вовлеченной аутосомы. Например, запись (формула) 47,ХХ+21 обозначает кариотип женщины с трисомией по 21 паре хромосом. Напротив, кариотип мужчины с экстрахромосомой Х изображают как 47,ХХY. При указании удлинения или укорочения плеча хромосомы после её символа ставят знак «плюс» или «минус». Напоминаем, что буква q символизирует длинное плечо, а p – короткое. Например, запись 46,XY,1q+ указывает на увеличение длинного плеча хромосомы 1. Формула 47,ХY+14р+ обозначает кариотип мужчины с 47 хромосомами, включая и дополнительную хромосому 14 с удлинением ее короткого плеча.

Сокращение – def (дефишенс), dup (дупликация), r (кольцо, возникающее после воссоединения двух разрывов в хромосоме), inv (инверсия) и t (транслокация) – обозначают аберрации хромосом. Номера хромосомы или хромосом помещают после сокращений в скобках. Например, запись 46,ХХ, r(18) означает кариотип женщины с 46 хромосомами, включая r-хромосому 18. Формула 46,Х, inv(Хq) – кариотип женщины с 46 хромосомами, включая одну нормальную Х хромосому и изохромосому Х (с двумя генетически идентичными длинными плечами). Бэнды помечаются числами по мере удаления от центромеры вдоль короткого (р) и длинного (q) плечей хромосомы. На записи кариотипа указывается и родитель, от которого унаследован полиморфизм хромосом, например: запись 46,ХХ,15ps+pat означает. Что женщиной от отца унаследованы увеличенные спутники по хромосоме 15. Материнское наследование обозначается записью mat.

С помощью цитогенетического метода выявлены хромосомные мутации типа реципрокных транслокаций, робертсоновских транслокаций и делеций. Так, транслокация 21-й хромосомы на другую 21, 22, 13, 14 или 15 вызывает синдром Дауна. Делеция короткого плеча Х хромосомы трактуется как моносомия по Х хромосоме, укорочение короткого плеча 21-й хромосомы называется филадельфийская хромосома, делеция короткого плеча хромосомы 5-й пары (синдром «кошачьего крика»), делеция длинного и короткого плеча 18-й хромосомы (нарушение строения лица, скелета, умственная отсталость, гипотрофия, гипотония и многие другие аномалии). В результате двух концевых нехваток образуются кольцевые хромосомы. При кольцевой 5-й хромосоме развивается синдром «кошачьего крика», в Х-хромосоме – клиническая картина близка синдрому Шерешевского-Тернера. Среди геномных мутаций наиболее часто встречается синдром Дауна (трисомия по 21 паре). Трисомия по 13 хромосоме вызывает синдром Патау, по 18 хромосоме – синдром Эдвардса. Среди анеуплоидных синдромов по половым хромосомам (ХО) – синдром Шерешевского-Тернера. У женщин описано три вида полисомий по Х-хромосоме: 47,ХХХ, 48,ХХХХ, 49,ХХХХХ. В кариотипе женщин с полисомией по Х-хромосоме увеличивается количество телец Барра. Полисомия по Х-хромосоме у мужчин называется синдром Клайнфельтера (47,ХХY), встречаются отклонения по числу Х хромосом 48,ХХХY и 48,ХХУУ.

У мужчин часто встречается полисомия по У хромосоме (47,ХУУ, 48.ХУУУ).

Метод определения полового хроматина. Это экспресс метод, который выявляет изменения числа половых хромосом в неделящихся клетках слизистой оболочки щеки. Половой хроматин, или тельце Барра, образуется одной из хромосом женского организма. Оно выглядит как интенсивно окрашенная глыбка, расположенная вблизи ядерной оболочки. При увеличении количества Х-хромосом в кариотипе организма образуются тельца Барра в количестве на единицу меньше числа Х-хромосом. При моносомии по Х-хромосоме тельце Барра отсутствует. Y хромосома в мужском кариотипе обнаруживается по более интенсивной люминесценции при обработке акрихинипритом и излучении в ультрафиолетовом свете. Число телец полового хроматина соответствует формуле

,

где В – число телец Барра,

Х – число Х-хромосом,

Р – плоидность.

ЗАДАНИЕ

1.  Изучите конспект лекции и материал учебников.

2.  Запишите в словарь и выучите основные термины и понятия: дизоксирибонуклеопротеиды (ДНП): эухроматин, гетерохроматин, кариотип, политенная хромосома, хромосома типа ламповых щеток, В-хромосомы кариотип, кариограмма, идиограмма, спутничная хромосома.

3.  Зарисуйте строение метафазной хромосомы, спутничной хромосомы, политенной хромосомы, хромосомы типа ламповых щеток.

4.  Подсчитайте число хромосом на метафазной пластинке, по заданию преподавателя. Постройте кариограмму на основании унифицированной Денверской номенклатуры, 1960 г.

5.  Измерьте абсолютную длину и плечи хромосом (в мм) и данные занесите в табл. 3.