Рабочая тетрадь к курсу «Биохимия» для студентов совместного Китайско-Российского института (стр. 2 )

12. В химии белка часто используют следующие реактивы:

а) СNBr;

б) мочевина;

в) бетамеркаптоэтанол;

г) трипсин;

д) надмуравьинная кислота;

е) дансилхлорид;

ж) 6 н НСl;

з) 2,4-динитрофторбензол;

и) нингидрин;

к) фенилизотиоцианат;

л) химотрипсин.

Какой из этих реактивов следует применить при решении следующих задач (ответ аргументируйте необходимыми реакциями).

1.  Обратимая денатурация белка, не содержащего дисульфидных связей. Какие понадобятся дополнительные реактивы, если в белке имеются дисульфидные связи?

2.  Определение аминокислотного состава пептида.

3.  Идентификация аминоконцевого остатка в пептиде, количество которого составляет порядка микрограммовых (а) и нанограммовых (б) количеств.

4.  Гидролиз пептидных связей по карбоксильной группе остатков лизина и аргинина.

5.  Гидролиз пептидных связей по карбоксильной группе остатков ароматических аминокислотных остатков.

6.  Расщепление пептидных связей по карбоксильной группе метионина.

7.  Определение последовательности аминокислот в небольшом пептиде.

13. Для пептида (адренокортикотропного гормона человека)

Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Asp-Ala-Gly-Glu-Asp-Gln-Ser-Ala-Glu-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu-Phe определите число фрагментов, образующихся при обработке и напишите структурную формулу самого короткого пептида при рН 8,5:

а) бромцианом;

б) трипсином;

в) химотрипсином.

14. Каким образом будет действовать трипсин на следующие пептиды:

а) Lys-Asp-Gly-Ala-Alа-Glu-Ser-Gly;

б) Ala-Ala-His-Arg-Glu-Lys-Phe-Ile;

в) Tyr-Cys-Lys-Ala-Arg-Arg-Gly;

г) Phe-Ala-Glu-Ser-Ala-Gly?

Каждый из образовавшихся фрагментов обрабатыватся затем 2,4-динитрофторбензолом, после чего следует гидролиз пептидных связей. Назовите образующиеся при этом 2,4-динитрофенильные аминокислоты.

15. Назовите пептиды, образующиеся при обработке химотрипсином следующего пептида:

Val-Ala-Lys-Glu-Glu-Phe-Val-Met-Tyr-Cys-Glu-Trp-Met-Gly-Gly-Phe.

Предположим, что образовавшиеся пептиды реагируют затем с бромцианом. Назовите образующиеся при этом продукты и напишите структурную формулу самого короткого пептида при рН 3.

16. Назовите пептиды, которые образуются, если пептид

Val-Ala-Lys-Glu-Glu-Phe-Val-Met-Tyr-Cys-Glu-Trp-Met-Gly-Gly-Phe

обработать трипсином, а образовавшиеся при этом фрагменты обработать затем бромцианом.

17. Какие способы вы применили бы к указанному ниже фрагменту гемоглобина, чтобы получить два таких набора пептидов с перекрывающимися последовательностями, при помощи которых можно было бы установить полную аминокислотную последовательность этого фрагмента? Последовательность, которую необходимо расшифровать, такова:

Val-Leu-Ser-Pro-Ala-Lys-Thr-Asn-Val-Lys-Ala-Ala-Trp-Gly-Lys-Val-Gly-Ala-His-Ala-Gly-Glu-Tyr-Gly-Ala-Glu-Ala-Thr-Glu.

18. В результате реакции тетрапептида с динитрофторбензолом и последующего гидролиза 6 н HCl образовались ДНФ-производное Ser и три другие аминокислоты. При гидролизе трипсином другой аликвотной пробы того же тетрапептида были обнаружены два фрагмента. При обработке гидролизата одного из фрагментов нингидрином выявляется продукт желтого цвета. Кратковременная инкубация с карбоксипептидазой приводит к появлению свободного лейцина. Присутствие каких аминокислот можно предположить в исходном тетрапептиде и какова их последовательность?

19. В результате кислотного гидролиза пептида А получены следующие аминокислоты: Asp, Lys, 2 Pro, Ser. После обработки динитрофторбензолом и кислотного гидролиза выявлен динитрофенилсерин. Частичный кислотный гидролиз привел к образованию пяти пептидов, содержащих следующие аминокислоты, полученные после полного гидролиза этих пептидов:

а) Pro, Ser; б) Pro, Asp; в) Lys, Pro, Asp; г) Lys, Pro; д) Asp, Lys.

Предположите последовательность аминокислот в пептиде А.

20. Выделенный из мозга опиоидный пептид лейэнкефалин, как установлено с помощью полного гидролиза и последующего аминокислотного анализа, содержит Gly, Leu, Phe, Tyr в соотношении 2:1:1:1. После обработки динитрофторбензолом найдено производное динитрофенил-тирозин. Свободного тирозина при этом не обнаружено. Гидролиз химотрипсином дал Leu, Tyr и более короткий пептид. Определите первичную структуру лейэнкефалина. Нарисуйте структурную формулу при рН 7,0.

21. Пентапептид, образующийся при обработке белка трипсином, содержит аргинин, аспартат, лейцин, серин, тирозин. Для определения аминокислотной последовательности провели три последовательных расщепления по Эдману. Полученные после каждого расщепления пептиды имели следующий состав:

первое расщепление - аргинин, аспартат, лейцин, серин;

второе расщепление - аргинин, аспартат, серин;

третье расщепление - аргинин, серин.

Какова последовательность пентапептида?

22. В гидролизате пептида найдены аланин, валин, глутамат, фенилаланин, тирозин, глицин, лизин, лейцин, метионин и NH3. При обработке пептида динитрофторбензолом выявлен ДНФ-аланин, карбоксипептидазой – глицин. В триптическом гидролизате обнаружено два пептида: первый состоит из Val, Ala, Glu, Lys, Phe; второй – из Met, Gly, Leu, Tyr, а при обработке динитрофторбензолом дает ДНФ-лейцин. В химотриптическом гидролизате найдено три пептида: первый содержит метионин и глицин; второй – Val, Ala, Phe, Glu; третьий - Leu, Tyr, Lys. Выведите на основании всей совокупности данных первичную структуру исходного пептида.

23. В гидролизате гормона найдены гистидин, лейцин, лизин, глицин, пролин, серин, триптофан, 2 моля глутамата, тирозин и NH3. Гормон устойчив к действию карбоксипептидазы. При обработке гормона по методу Сэнгера выявлен ДНФ-глутамат. В химотриптическом гидролизате обнаружены тетрапептид, состоящий из серина, лейцина, глутамата и триптофана, и два трипептида: первый содержит тирозин, глутамат и гистидин, второй – глицин, лизин, пролин. При обработке тетрапептида по методу Сэнгера найден ДНФ-серин. В триптическом гидролизате обнаружено два пептида: первый содержит гистидин, лейцин, лизин, серин, триптофан, тирзин и два моля глутамата. Второй окрашивается нингидрином в желтый цвет. Выведите на основании всей совокупности данных первичную структуру исходного гормона.

24. При полном кислотном гидролизе одного из гормонов человека было установлено, что этот гормон состоит из девяти аминокислот: 2 Cys, Tyr, Pro, Gly, Leu, sp, Glu, Ile. При этом выделяется также 3 моля NH3. Обработка гормона динитрофторбензолом и последующий кислотный гидролиз приводят к обнаружению динитрофенилцистеина. Гормон не гидролизуется карбоксипептидазой. Обработка гормона химотрипсином после восстановления дисульфидных связей приводит к образованию двух фрагментов. Первый – дипептид, при рН 6,0 не заряжен. При обработке второго фрагмента динитрофторбензолом с последующим кислотным гидролизом обнаруживается динитрофенилизолейцин. Частичный кислотный гидролиз выявил следующие пептиды: Ile-Glu, Pro-Leu, Pro-Leu-Gly, Asp-Cys-Pro. Напишите аминокислотную последовательность гормона.

25. Пептид А, в состав которого входят лизин, гистидин, аспартат, 2 моля глутамата, аланин, пролин, валин, тирозин и две молекулы аммиака, дает в результате реакции с динитрофторбензолом ДНФ-Asp, а при обработке карбоксипептидазой – свободный Val. При расщеплении пептида А трипсином получаются два пептида. Один из них (Lys, Asp, Glu, Ala, Tyr) нейтрален при рН 5,5, а другой (His, Glu, Pro, Val) дает ДНФ-His и при рН 5,5 несет положительный заряд. Кроме того, из пептида А получаются два пептида в результате действия химотрипсина. Один из них (Asp, Ala, Tyr) при рН 5.5 нейтрален, а другой (Lys, His, 2 Glu, Pro, Val) – положительно заряжен. Укажите структуру пептида А.

1.2. ХИМИЧЕСКОЕ СТРОЕНИЕ И ПРОСТРАНСТВЕННАЯ СТРУКТУРА НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ, ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПЕРВИЧНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ

Рис. 3. Гетероциклические основания нуклеиновых кислот

Рис. 4. Вторичная структура ДНК

ЗАДАЧИ И УПРАЖНЕНИЯ

1. ДНК одного делеционного мутанта бактериофага λ имеет контурную длину 15 мкм вместо 17 мкм. Сколько пар оснований недостает у этого мутанта?

2. Напишите комплиментарные последовательности (в стандартной записи 5’-3’) для следующих последовательностей:

а) GATCA;

б) TCGAAC;

в) ACGCGT;

г) TACCAT.

3. Расположите олигонуклеотиды в порядке убывания температуры плавления их комплементарных комплексов:

а) dpATATATATAT;

б) dpGCGCGCGCGC;

в) dpATGCATGCAC.

Изобразите схематически вид интегральных кривых плавления для всех трех комплексов.

4. Расположите олигонуклеотиды в порядке убывания температуры плавления их комплиментарных комплексов:

а) ATGCATGCAТ;

б) ATGCATGCAТGC;

в) ATGCATGC.

Изобразите схематически вид дифференциальных кривых плавления всех трех комплексов.

5. Найдено, что очищенный препарат ДНК содержит 30,4 % аденина и 19,6 % цитозина. Отношение аденин / тимин равно 0,98, а гуанин / цитозин – 0,97. Вычислите количество гуанина и тимина в этой ДНК, а также соотношение пуриновых и пиримидиновых оснований.

6. Нарисуйте все возможные варианты образования неканонической пары:

а) A-G;

б) А-С.

7. Нарисуйте взаимное расположение гетероциклов в тройном комплексе полигуаниловой кислоты с двумя цепями полицитилдиловой кислоты.

Рис. 5. Метод Сэнгера

Рис. 5. Механизм модификации оснований ДНК методом Максама – Гилберта (окончание на с. 31)

8. Какие продукты должны получиться при частичном гидролизе олигорибонуклеотида 5’-pGCAGUACUGUC-3’ следующими ферментами:

а) панкреотической рибонуклеазой (РНКазаА);

б) рибонуклеазой Т1;

в) рибонуклеазой U2?

Нарисуйте их структурные формулы.

9. На рисунке приведена схема радиоавтографа геля с четырмя дорожками фрагментов дезоксирибоолигонуклеотида, образовавшихся при химическом расщеплении.