Рабочая тетрадь к курсу «Биохимия» для студентов совместного Китайско-Российского института (стр. 3 )

G+A	G	C+T	C

Олигонуклеотид содержал 32Р-метку на 5'-конце. Какова последовательность исследуемого нуклеотида?

10. Напишите последовательности (с указанием концевых фосфатных групп) всех продуктов, образующихся при обработке олигонуклеотида dpCATTCGTTC 66-й % муравьиной кислотой (1 час), а затем 10-м % пиперидином (95 °С, 30 мин). Нарисуйте схему радиоавтографа геля с фрагментами олигонуклеотида, образовавшихся при химическом расщеплении. Нарисуйте структуру самого короткого нуклеотид-содержащего продукта реакции.

11. Напишите последовательности (с указанием концевых фосфатных групп) всех продуктов, образующихся при последовательной обработке олигонуклеотида dpGTGACGTGAT гидразингидратом в присутствии 1 М NaCl и 1 М пиперидином. Нарисуйте схему радиоавтографа геля с фрагментами олигонуклеотида, образовавшихся при химическом расщеплении. Нарисуйте структуру самого короткого нуклеотид-содержащего продукта реакции.

12. Напишите последовательности (с указанием концевых фосфатных групп) всех продуктов, образующихся при последовательной обработке олигонуклеотида dpATACGGGTA гидразингидратом и 1 М пиперидином. Нарисуйте схему радиоавтографа геля с фрагментами олигонуклеотида, образовавшихся при химическом расщеплении. Нарисуйте структуру самого короткого нуклеотид-содержащего продукта реакции.

13. Напишите последовательности (с указанием концевых фосфатных групп) всех продуктов, образующихся при последовательной обработке олигонуклеотида dpCGGTGACGTGAT диметилсульфатом и 1 М пиперидином. Нарисуйте схему радиоавтографа геля с фрагментами олигонуклеотида, образовавшихся при химическом расщеплении. Нарисуйте структуру самого короткого нуклеотид-содержащего продукта реакции.

14. Напишите последовательности (с указанием концевых фосфатных групп) всех продуктов, образующихся при последовательной обработке олигонуклеотида dpGACTTAGCTAAAGT гидразингидратом в присутствии 1 М KOH и 1 М пиперидином. Нарисуйте схему радиоавтографа геля с фрагментами олигонуклеотида, образовавшихся при химическом расщеплении. Нарисуйте структуру самого короткого нуклеотид-содержащего продукта реакции.

15. Цепь ДНК содержит последовательность

5’-----ATCGTAC---3’

Ее структуру определили методом Сэнгера. Нарисуйте радиоавтограф геля с четырьмя дорожками фрагментов ДНК, образующихся при использовании в качестве терминаторов ddGTP, ddCTP, ddTTP, ddATP.

16. Почему при секвенировании ДНК химическим методом матрица должна быть мечена по одному концу, а в методе Сэнгера метка может быть распределена равномерно по всей длине цепи?

ГЛАВА 2. КИНЕТИКА ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ. ИНГИБИРОВАНИЕ

Рис. 5. Уравнение Михаэлиса — Ментен

Рис. 6. Графики Лайнуивера — Берка (слева) и Иди-Хофсти (справа) в отсутствие и в присутствии конкурентного ингибитора

Рис. 7. Графики Лайнуивера — Берка (слева) и Иди-Хофсти (справа) в отсутствие и в присутствии неконкурентного ингибитора

Рис. 8. Уравнение Михаэлиса — Ментен в присутствии конкурентного (слева) и неконкурентного (справа) ингибитора

ЗАДАЧИ И УПРАЖНЕНИЯ

1. Установите соответствие:

ферменты	катализируемая реакция
1) протеиназа	а) переносит электроны
2) цитохром С	б) расщепляет Н2О2
3) протеинкиназа	в) фосфорилирует белок
4) каталаза	г) гидролизует 1,4-гликозидные связи
5) ά-амилаза	д) гидролизует пептидные связи

2. Определите значения кинетических параметров k2 и Км гидролиза метилового эфира N-ацетил-L-валина, катализируемого альфа-химотрипсином, исходя из данных таблицы.

[S0], М	V0 · 106, М · с-1
0,2	4,57
0,124	3,83
0,091	3,32
0,071	2,95
0,06	2,7

Условия реакции:

[E0] = 3,85 · 10-5 M;

pH = 7,8; 25 °C; 0,1 M КСl.

[S]0 ∙103, M	V0 ∙107, M∙c-1
2,24	4,28
1,49	3,56
1,12	3,11
0,9	2,74
0,75	2,43

Определите значения кинетических параметров k2 и Км гидролиза метилового эфира N-бензоил-L-аминомаслянной кислоты, катализируемого альфа-химотрипсином, исходя из данных таблицы.

Условия реакции: [E0] = 2,16 · 10-5 M; pH = 7,8; 25 °C; 0,1 M КСl.

Концентрация Mg-АТФ, мкМ	100	30	20	15	10
Скорость образования продукта (о. е./мин)	0.3	0.19	0.14	0.09	0.05

3. Фосфофруктокиназа катализирует следующую реакцию:

Фруктозо-6-фосфат + АТФ → фруктозо-1,6-дифосфат + АДФ.

Рассчитайте величину KM для АТФ исходя из приведенных ниже данных. Концентрация фруктозо-6-фосфата оставалась постоянной (1 мМ).

4. Измеряли кинетику ферментативной реакции в зависимости от концентрации субстрата в присутствии ингибитора (концентрация 10-5 М) или в его отсутствие; были получены следующие данные:

[S]0∙10-5, M	Скорость реакции, мкмоль/мин
без ингибитора	с ингибитором
0.3	10.4	4.1
0.5	14.5	6.4
1.0	22.5	11.3
3.0	33.8	22.6
9.0	40.5	33.8

а) Чему равны Vmax и KM в отсутствие ингибитора? В его присутствии?

б) Каков тип ингибирования?

в) Чему равна константа связывания ингибитора?

5. Ферменты необратимо ингибируются под действием:

а) липидов;

б) аминокислот;

в) ионов тяжелых металлов;

г) углеводов.

6. Установите соответствие:

субстрат, определяемый с помощью ферментного электрода	фермент, входящий в состав ферментного электрода
1) мочевина	а) аспарагиназа
2) глюкоза	б) алкогольдегидрогеназа
3) этанол	в) глюкозооксидаза
4) лактат	г) лактатдегидрогеназа
5) аспарагин	д) уреаза

7. Из приведенных ниже данных для глутаматдекарбоксилазной реакции определите, является ли действие ингибитора – бромпирувата конкурентным или неконкурентным. Вычислите также величину KM для субстрата – глутаминовой кислоты – и значение ki для фермент-ингибиторного комплекса. Определите значение Vmax.

Концентрация глутамата, мМ	14	7	5	3	2.3
Скорость образования продукта в отсутствие бромпирувата, мкМ/мин∙102	62	55	45	37	32
Скорость образования продукта в присутствии 20 мМ бромпирувата, мкМ/мин∙102	56	42	35	26	21