Избранные достижения из Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология».
Эта программа состоит из пяти разделов, каждый равный по объему обычной программе Президиума РАН. Поэтому мы даем не 10, а 17 крупных достижений, хотя их число можно легко увеличить до 40-50 (если Президиум желает, это можно сделать в течение 1-2 дней).
Последовательность достижений в значительной мере произвольна из-за трудности проведения сравнения. Как и требовалось на первые два места ставились достижения с иллюстрациями.
1. Впервые разработана система внутритканевого возбуждения фотосенсибилизаторов с помощью антистоксовых нанофосфóров и рибофлавина, вызывающих стойкую регрессию опухоли при облучении ближним инфракрасным светом. Разработанная система может стать основой для решения проблемы доставки света вглубь тканей и расширения возможностей фотодинамической терапии. Впервые для глубокой фотодинамической терапии разработаны системы внутритканевого возбуждения фотосенсибилизаторов. Впервые предложено проводить фотоактивацию фотосенсибилизаторов при облучении ближним инфракрасным светом, проникающим в ткани на глубину 4-6 мм, за счет его апконверсии в УФ-свет с помощью антистоксовых нанофосфóров НАФ(Tm3+) и безызлучательной передачи энергии по механизму FRET. Показано фотоиндуцированное цитотоксическое действие FRET-пары рибофлавин:НАФ(Tm3+) на клетки аденокарциномы яичника человека SKOV3 in vitro при облучении лазером с длиной волны 975 нм. Показано, что одновременное введение в опухоль антистоксовых нанофосфóров НАФ(Tm3+) и рибофлавина вызывает стойкую регрессию опухоли под воздействием лазера с длиной волны 975 нм (доза 900 дж/кв. см). Разработанные системы могут стать основой для решения проблемы доставки света вглубь тканей и расширения возможностей фотодинамической терапии опухолей
глубинных тканей и метастазов.
Ч-к СМ Деев ИБХ.
2. Заново отредактирована и издана книга: Finkelstein A.V., Ptitsyn O.B. Protein Physics. A Course of Lectures, 2-nd Edition.
Finkelstein A. V., Ptitsyn O. B. Protein Physics. A Course of Lectures. 2nd Edition. Academic Press, An Imprint of Elsevier Science; Amsterdam • Boston • Heidelberg • London •New York • Oxford • Paris • San Diego • San Francisco • Singapore • Sydney • Tokyo; 2016; xx + 506 pages.
Ч-к АВ Финкельштейн ИБ
3. В структурах α-субъединицы Na,K-АТФазы обнаружены полости с неразрешенной электронной плотностью, соответствующей молекулам базально-связанного глутатиона. Показано, что базальное глутатионилирование Na,K-АТФазы является новой ко-трансляционной модификацией. Na, K-АТФаза – трансмембранный фермент, создающий градиент Na+ и K+ за счет гидролиза АТФ. Альфа субъединица Na, K-АТФазы подвергается базальному и регуляторному глутатионилированию. Базальное глутатионилирование может быть снято только с денатурированного белка, т. е. Na, K-АТФаза содержит глутатионилированные цистеиновые остатки, недоступные для восстановителей. Анализ всех известных кристаллографических структур Na, K-АТФазы выявил ряд замкнутых полостей в районе остатков цистеина с неразрешенной плотностью, соответствующих молекуле глутатиона. Эти данные свидетельствует в пользу того, что остатки цистеина в таких полостях были глутатионилированы ко-трансляционно в процессе синтеза и фолдинга белка. Можно прогнозировать обнаружение подобных неразрешенных плотностей вблизи цистеиновых остатков в других белках, способных глутатионилироваться. Поскольку базово глутатионилированные остатки не доступны для деглутатионилирующих агентов, то паттерн базового глутатионилирования является отражением редокс-статуса клетки в момент фолдинга белка.
Ак. АА Макаров ИМБ
4. Разработан метод поиска белков, способных связывать синтетические красители-флуорогены Мы впервые применили автоматический молекулярный докинг GFP-подобных хромофоров к множеству (более 3000) белков бактерии E. coli с известной пространственной структурой. В результате были идентифицированы белки-кандидаты и для двух из них экспериментально продемонстрировано специфическое связывание с Kaede-подобными синтетическими хромофорами. Например, хромофор А12Н связывался с субмикромолярной аффинностью с белками 1PVS и 3HO2 (индексы в базе белковых структур PDB), что сопровождалось многократным усилением его флуоресценции за счет возрастания квантового выхода флуоресценции хромофора в составе комплекса с белком (Рис. 1). Дальнейшее применение разработанного подхода может включать несколько направлений. Во-первых, найденные пары флуороген-белок могут служить метками для флуоресцентной микроскопии. Во-вторых, новый метод открывает перспективы флуоресцентного мечения эндогенных клеточных белков. Наконец, увеличение флуоресценции флуорогенных красителей при связывании с белком может быть использовано как простой и надежный способ экспериментального сравнения и верификации различных протоколов молекулярного докинга. Работа была выполнена в сотрудничестве с группой синтеза природных соединений (ИБХ РАН) под руководством .
Рис. 1. Изменения спектра эмиссии хромофора А12Н (структура показана справа) при связывании с белками 1PVS и 3HO2.
Ч-к Лукьянов КК ИБХ.
5. На основании анализа результатов молекулярной динамики одно - и двухкомпонентных липидных мембран различного состава в различных силовых полях получено, что в большинстве случаев поверхность мембраны не является однородной и гидрофильной, а имеет мозаичную структуру с чередованием гидрофобных и гидрофильных участков. Принято считать, что липидные мембраны имеют гидрофобную внутреннюю часть и гидрофильную поверхность. Нами проведен анализ гидрофобных свойств поверхности одно - и двух компонентных липидных мембран различного состава, полученных методами молекулярной динамики в 3 различных силовых полях. Обнаружено (рис. 1), что поверхность мембран имеет мозаичную структуру с чередующимися гидрофобными и гидрофильными кластерами. Мозаичная структура поверхности мембраны наблюдается во всех рассмотренных силовых полях. При увеличении доли анионного липида (DOPS) в смеси анионного и цвитерионного липидов (DOPS/DOPC) увеличивается средний размер гидрофобного кластера, при этом наиболее резкое изменение наблюдается в диапазоне концентраций анионного липида 15-30%. Такое поведение наблюдается во всех рассмотренных силовых полях. Таким образом, мишенью для связывания белков служат мембраны определенного химического состава.
Рис. 1. Распределение гидрофобных/гидрофильных свойств на поверхности мембраны. Вверху – двумерные карты молекулярного гидрофобного потенциала (MHP) для однокомпонентных систем в силовых поля Slipids и CHARMM36, и для двух-компонентных систем DOPS/DOPC в поле CHARMM36. Внизу – зависимость среднего размера гидрофобных кластеров (MHP > 0,5) от концентрации анионного липида (DOPS) в смеси анионного и цвитерионного (DOPC) липидов.
Дфмн РГ Ефремов ИБХ
6. Обнаружено, что РНК-хеликаза, кодируемая геном bel, необходима для поддержания стволовых клеток зародышевого пути и их дальнейшей дифференцировки в процессе сперматогенеза у дрозофилы. Показано, что нарушение образования РНК-хеликазы Bel приводит к резкому снижению количеств циклинов А и В. Эффект наблюдается только в отношении клеток зародышевого пути, деления соматических клеток семенника не затрагиваются. Ген bel является гомологом гена DBY человека, мутационные нарушения которого приводят к стерильности мужчин, вызванной резким нарушением образования клеток зародышевого пути при сохранении соматических клеток (клеток Сертоли) семенника. Наблюдаемый фенотип при мутации в гене bel у дрозофилы имитирует синдром (Sertoly Сell-Only Syndrome). Поэтому дрозофила может служить моделью для исследования природы нарушений при синдроме «только клетки Сертоли» тех молекулярно-генетических механизмов, в которых участвует РНК-хеликаза как шаперон РНК.
Ак. ВА Гвоздев ИМГ.
7. Белок CP190 связывается со всеми хорошо исследованными инсуляторными/архитектурными белками дрозофилы. Было показано, что CР190 участвует в рекрутировании на регуляторные элементы репрессора INSV. Белок CP190 является ключевым компонентом основных известных инсуляторных комплексов дрозофилы. Одновременно белок СР190 нужен для активности многих промоторов. Предполагается, что CP190 является рекрутером белковых комплексов на регуляторные элементы. В процессе раннего развития дрозофилы большую роль играют транскрипционные репрессоры, среди которых был идентифицирован INSV. Белок INSV имеет димеризующийся домен на N-конце и высококонсервативный BEN домен на С-конце. В ходе выполнения проекта в 2016 году было показано, что М и BTB домены белка СР190 взаимодействует с 20 а-к доменом белка INSV. Этот домен белка INSV не нужен для репрессии в модельных системах. Однако было показано, что взаимодействие между CP190 и INSV нужно для привлечения последнего на инсуляторы в bithorax комплексе.
Ак. ПГ Георгиев ИБГ.
8. Определена структура высокого разрешения для гамма субъединицы архейного фактора инициации трансляции 2 и на основе её выдвинута модель переноса образующегося при гидролизе ГТФ протона. В археях и эукариотах связывание Met-tRNAiMet к P сайту малой рибосомной субчастицы происходит с помощью фактора инициации трансляции 2 (a/eIF2), который состоит из трёх субъединиц: альфа, бета и гамма. Нами была определена структура высокого разрешения (1,6 Å) для гамма субъединицы фактора инициации трансляции 2 из археи Sulfolobus solfataricus (SsoIF2γ) в комплексе с аналогом ГТФ, GDPCP. Три кластера хорошо определяемых молекул воды ассоциированы с амино-кислотными остатками нуклеотид-связывающего кармана SsoIF2γ и стабилизируют его конформацию (Рис. 1а). Мы предполагаем, что два водных мостика между атомами кислорода гамма-фосфата ГТФ и отрицательно заряженными остатками кармана могут служить путём переноса протона, образующегося при каталитической реакции (Рис. 1б).
А Б
Рис. 1. А) В области нуклеотид-связывающего кармана могут быть выделены три водных кластера, которые стабилизируют структуру кармана и экранируют нуклеотид от неструктурированного растворителя. Б) Предполагаемые пути переноса протона, образующегося при гидролизе ГТФ.
Дбн МБ Гарбер ИБ
10. Экспериментально показано изменение транскриптома клеток головного мозга крыс под действием фармакологически активных пептидов, что в значительной степени определяет их клиническое действие. Если воздействие на определённые рецепторные системы уже давно исследуется фармакологами, то активация определённых генов, вызывающая направленное изменение протеома и, как следствие, определённые физиологические ответы, – новая область фармакологии, новая мишень фармакологического воздействия. Физиологически активные пептиды служат наиболее приемлемым инструментом такого воздействия. Изучено изменение транскриптома нейронов под действием пептидов семакс, селанк, Thr-Lys-Pro-Аrg, Pro-Gly-Pro, Gly-Pro, Аrg-Pro-Gly-Pro. Совокупность этих результатов показывает, что изменение транскриптома клеток головного мозга крысы под действием исследованных пептидов в значительной мере определяет их клинические эффекты.
Ак. НФ Мясоедов ИМГ.
11. Везикулы, несущие белок ЕЕА1, присутствуют в нестимулированных эпидермальным ростовым фактором клетках и не являются аутофагосомами. Эти новые данные раскрывают возможные пути биогенеза ЕЕА1-везикул в клетке. В соответствии с современной моделью, стимуляция эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов приводит к рекрутированию на ранние эндосомы цитоплазматического белка EEA1, необходимого для их дальнейшего слияния. Однако EEA1-положительные везикулы выявляются и в не стимулированных ростовым фактором клетках, инкубировавшихся в условиях лишения сыворотки. Известно также, что длительное сывороточное голодание индуцирует в клетках образование аутофагосом, в котором могут принимать участие компартменты эндоцитозного пути. Чтобы проверить, не являются ли EEA1-везикулы, выявляемые в клетках в условиях сывороточного голодания, аутофагосомами, мы исследовали динамику изменения количества и средних размеров EEA1- и LC3- положительных везикул, а также оценили колокализацию белка EEA1 с маркером аутофагосом LC3, в клетках HeLa, культивируемых в течение 12--36 ч в среде с дефицитом компонентов сыворотки. Оказалось, что количество аутофагосом в среднем гораздо меньше числа EEA1-везикул на клетку. Показано, что индукция голодания приводила к увеличению лишь среднего размера аутофагосом, в то время как количество и средний размер EEA1-везикул не изменялись. Колокализация белков EEA1 и LC3 в клетках, культивируемых в бессывороточных условиях в течение 12-18 ч была очень низкой и незначительно возрастала к 36 ч. Блокирование биосинтетического пути с помощью Брефельдина А, вызывающего разборку аппарата Гольджи, приводило к уменьшению числа и увеличению среднего размера EEA1-везикул, а также увеличению среднего размера LC3-везикул и их колокализации с EEA1. Таким образом, большинство EEA1-везикул, присутствующих в клетках, культивируемых в условиях сывороточного голодания, не являются аутофагосомами. Более выраженный эффект Брефельдина А указывает на то, что он, по-видимому, является более сильным фактором стресса по сравнению с лишением сыворотки, а также позволяет предполагать существенную роль биосинтетического пути в биогенезе EEA1-везикул.
Акю НН Никольский ИНЦ.
12. Показано, что различные изоформы Oct-1 контролируют экспрессию различных, хотя и перекрывающихся генов и их высокий уровень в клетках опухоли стимулирует ее прогрессию и является плохим прогностическим признаком. Авторами были определены процессы в клетках, на которые влияет высокий уровень Oct-1. Был проведен анализ экспрессии генов и процессов, зависящих от высокого уровня Oct-1 и выявлены те из них, которые могут стимулировать рост и развитие опухолевых клеток. Были проведены эксперименты по изучению влияния Oct-1 на процесс пролиферации, апоптоза, смещения метаболизма. Для этого были использованы клетки, стабильно трансформированные изоформами Oct-1 (полученные на предыдущем этапе) и контрольные клетки. Определена роль отдельных изоформ Oct-1 в этом процессе.
Ч-к СГ Георгиева ИМБ.
13. Создана крупнейшая база данных участков ДНК, специфически связывающих транскрипционные факторы, с учетом всех имеющихся в настоящее время данных по ДНК-белковому взаимодействию. Существующая с 2013г. коллекция участков ДНК, специфически связывающих факторы транскрипции HOCOMOCO (http://hocomoco. autosome. ru и http://www. cbrc. kaust. edu. sa/hocomoco10), существенно пополнена моделями, построенными для транскрипционных факторов, изученных в последнее время. Всего сейчас HOCOMOCO содержит 601 моделей участков связывания ТФ в геноме человека и 396 моделей участков связывания ТФ в геноме мыши. Создана оригинальная методика кросс-валидации качества экспериментов ChIP-seq, позволившая отсеять несколько сот экспериментов, как недостаточно информативных.
Дфмн ВГ Туманян ИМБ
14. Определены некоторые белки, составляющие центральную (белковую) часть кариосферы ооцитов мыши. В ходе изучения пространственной архитектоники клеточного ядра, структуры и функций субъядерных органелл ооцитов впервые показано, что ядрышкоподобные тела (NLBs, или постъядрышки), формирующую центральную (белковую) часть кариосферы ооцитов мыши, не содержат актин и ДНК-топоизомеразу II. При этом показано, что ламин B вовлечен в начальные этапы формирования NLBs, а ламин A и теломер-связывающий белок TRF2 демонстрируют быстрое продвижение к NLBs до конца оогенеза. Доказано, что актин в разных формах занимает в ооците разные позиции.
Рис. 1. Двойное иммунофлуоресцентное окрашивание ядер ооцитов мыши с помощью антител к TRF2 (красный) и другими антителами (зеленый). Слева для каждой панели изображений (a, b, c, d) указаны стадии развития ооцита. A — антитела к ламину A;
B — антитела к ламину B. Первое изображение в каждом ряду — DAPI (ДНК), M — совмещенные изображения. C — обработка указана на каждом изображении;
D — окрашивание антителами к TRF2 и DAPI ядра ооцита при переходе от стадии 2 к стадии 3. Масштабный отрезок = 10 мкм на всех изображениях.
Рис. 2. Ядро ооцита стадии 3 после двойного окрашивания антителами к белку SC35 (зеленый) и Topo II (красный). Окрашивание DAPI (ДНК) показано в режиме grayscale;
M — совмещенное изображение. Масштабный отрезок = 10 мкм.
Рис. 3. Иммуноэлектронное мечение ядерных структур ооцитов мыши антителами к TRF2, ламину B и ламину A. TRF2 — компонент NLB на стадии 3, кластер интерхроматиновых гранул (IGCs) на этой стадии содержит лишь несколько меток, в то время как на предыдущей стадии IGCs интенсивно мечены (врезка); NLB ооцита 1-й стадии обогащено ламином B. Обратите внимание на рыхлую структуру NLB на 1-й стадии и отсутствие блоков конденсированного хроматина на его периферии. На 3-й стадии NLB обогащено ламином A. Обратите внимание на блоки конденсированного хроматина (Chr) на поверхности NLB.
Дбн ДС Боголюбов ИНЦ
15. Обнаружена новая роль TNF в росте солидных опухолей и метастазировании. Это обстоятельство указывает на дополнительные бенефиты анти-цитокиновой терапии.
Ак. СА Недоспасов ИМБ.
16. Показан защитный эффект тимусного пептида тимулина в условиях острого аутоиммунного воспаления у мышей. Внутривенное введение пероксиредоксина 6 перед ишемически-реперфузионном поражении кишечника восстанавливает уровень перфузии кровью кишечной ткани на фоне снижения поражения слизистой оболочки во всем органе. Одновременно уменьшается поражение сосудов брыжейки, что выражается в сохранении миогеннного тонуса и сохранения эндотелиальных клеток сосудов. Исследована выживаемость мышей при их облучении в летальной дозе 7-10 Гр после внутривенного введения рекомбинантного пероксиредоксина 6. Показано, что пероксиредоксин 6 является мощным природным радиопротектором и проявляет радиозащитные свойства через свои антиоксидантную, шаперонную и сигнально-регуляторную активности.
Ч-к ЕЕ Фесенко ИБК.
17. При раке толстой кишки обнаружено значительное (в среднем в 5-9 раз) и частое (в 60-83% случаев) снижение уровня мРНК генов PLCL2, PPP2R3A, PRICKLE2 и ALDH1L1, ассоциированное с гиперметилированием их промоторных областей. Исследованные гены являются новыми потенциальными генами-супрессорами опухолевого роста при раке толстой кишки. Проведен совместный анализ данных по частоте гиперметилирования/делеций 188 генов хромосомы 3 человека, полученных нами с применением оригинальных NotI-микрочипов, и материалов ресурса TCGA (The Cancer Genome Atlas) о статусе метилирования ДНК и уровне экспрессии 40 генов с высокой частотой нарушений по данным NotI-микрочипов при раке толстой кишки. Для дальнейшей оценки уровня мРНК методом количественной ПЦР на репрезентативной выборке парных (опухоль/«условная норма») образцов толстой кишки отобрано 4 гена: PLCL2, PPP2R3A, PRICKLE2 и ALDH1L1. Обнаружено значительное (в среднем в 5-9 раз) и частое (более чем в 60% случаев) снижение экспрессии каждого из исследованных генов. Гены PLCL2, PPP2R3A, PRICKLE2 и ALDH1L1 являются новыми потенциальными генами-супрессорами опухолевого роста при раке толстой кишки. Кроме того, уровень мРНК исследованных генов в дальнейшем может быть использован для разработки системы молекулярных маркеров для диагностики злокачественных опухолей толстой кишки.
Кбн АА Дмитриев ИМБ
