Влияние возраста и пониженного содержания кислорода на функциональные свойства культивируемых мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга крыс (стр. 2 )

Клеточный прирост определяли, подсчитывая количество ММСК на микрофотографиях рандомически выбранных фиксированных полей зрения на разных сроках культивирования с помощью программы SigmaScan Pro 5.0 Image Analysis Software (SPSS Inc, USA). Число удвоений рассчитывали по формуле n = 3,32 lg (x/x0). Для определения числа КОЕ-Ф среди клеток, выделенных из костного мозга крыс разного возраста, в чашки Петри (Ø35мм) помещали 0,5 мл суспензии. При субкультивировании ММСК рассевали в такие же чашки с плотностью 24 кл/см2. Через 14 дней культуры окрашивали кристаллическим фиолетовым и подсчитывали КОЕ-Ф. «Стареющие» кмММСК выявляли по увеличению активности бета-галактозидазы, которая выявлялась гистохимически при деградации субстрата 5-бромо-4-хлоро-3-индоил-бета-D-галактопиранозида - X-gal (X-gal-положительные клетки). Иммунофенотипирование кмММСК проводили после 1-3 пассажа, используя антитела к следующим антигенам: CD90; CD54; CD44; CD11b; CD73; CD45 на проточном цитофлуориметре Epics XL (Beckman Coulter, США), согласно инструкции производителя. Способность кмММСК к мультилинейной дифференцировке характеризовали после индукции соответствующими дифференцировочными средами (индуцированная дифференцировка) и без них (спонтанная дифференцировка). Начальные этапы (7 сут.) остеогенной дифференцировки (состав среды - α-МЕМ, 200мМ глутамин, 100мМ пируват натрия, антибиотики/антимикоти (1%), 10% ФТС, 10-8М дексаметазона, 10мМ глицерол-2-фосфата и 0,2мМ 2-фосфо-L-аскорбиновой кислоты) кмММСК оценивали гистохимически по наличию в клетках активности щелочной фосфатазы (характерного раннего маркера остеобластов) с помощью набора Alkaline Phosphatase Kit (Sigma-Aldrich, США). Адипогенную дифференцировку (состав среды - α-МЕМ, 200мМ глутамин, 100 мМ пируват натрия, антибиотики/антимикоти (1%), 10% ФТС, 0,5мМ изобутилметилксантина, 1μМ дексаметазона, 10μг/мл инсулина ) определяли после 14 сут. по появлению в культуре клеток, накапливающих в цитоплазме жировые капли, выявляемые с помощью красителя Oil Red О (Sigma, США).

Исследование репаративного потенциала культивируемых кмММСК разновозрастных крыс было выполнено на 58 самцах линии Wistar (вес 200-300 г.). В 1 серии животным вводили кмММСК от 1,5 месячной крысы, а во 2 серии животным – кмММСК от 12-месячной крысы в область оперативного перелома малоберцовой кости (Разрешение биотической комиссии ГНЦ РФ - ИМБП РАН). Экспансия вводимых кмММСК была предварительно проведена ex vivo. В каждой серии животные были разделены на 4 группы. I – только оперативный перелом (П); II – перелом и введение в зону повреждении 0,25 мл αМЕМ (П+ αМЕМ); III - перелом и введение 0,25 мл αМЕМ с 5·105 кмММСК после экспансии при 20% О2 (П+ αМЕМ+ кмММСК/20%); IV - перелом и 0,25 мл αМЕМ с 5·105 кмММСК после экспансии при 20% О2 (П+ αМЕМ+ кмММСК/5%). Через 14 дней животных выводили из эксперимента и выделяли участки костей с костными мозолями, образовавшимися в местах переломов. Гистологические срезы окрашивали гематоксилином и эозином (Г-Э) (общая морфология), толуидиновым синим (ТС) (кислые мукополисахариды), пикрофуксином (ПФ) (коллагеновые волокна) для определения состава тканей, образующих костную мозоль, и коэффициента ее утолщения (отношение диаметра костной мозоли к диаметру костных отломков).

Достоверность различий значений определялась с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни с использованием программы Statistica 6. Расчет средних значений и стандартного отклонения проводилось с помощью программы Microsoft Excel.

Объем проведенных исследований

Морфофункциональная характеристика кмММСК разновозрастных крыс (пролиферация, КОЕ, дифференцировка, X-gal, иммунофенотип)
Группы животных	Кол-во животных	Кол-во исследованных популяций кмММСК
1 месяц	12	20%	12
5%	12
6-8 месяцев	6	20%	6
5%	6
>12 месяцев	6	20%	6
5%	6
итого	24	48
Оценка репаративного потенциала
Группы животных	Кол-во животных	Кол-во гист. срезов
Г - Э	ТС	ПФ
Контрольная (П)	14	14	20	18
Контроль со средой (П+ аМЕМ)	14	13	18	19
1,5 месяц (П+ αМЕМ+ кмММСК)	20%	7	8	7	8
5%	7	8	7	8
>12 месяцев (П+ αМЕМ+ кмММСК)	20%	6	14	6	14
5%	6	12	6	12
итого		60	53	80	89

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Характеристика кмММСК в первичной культуре. На третий день культивирования во всех группах клетки располагались одиночно и/или группами (рис. 1). Клетки имели вытянутую форму с несколькими длинными отростками, однако встречались и округлые клетки с неоднородной цитоплазмой. В первичных культурах сохранялись клетки, морфологически сходные с клетками крови, которые могли располагаться также на кмММСК. Через шесть дней культивирования количество клеток в фиксированных полях зрения значительно увеличивалось по сравнению с 3-м днем культивирования, при этом при 5% кислорода клетки были мельче и более вытянутыми по сравнению с культивированием при 20% кислорода, что было описано нами ранее ( и , 2007). К девятому дню клетки преимущественно образовывали монослой, исключение составляли некоторые культуры ММСК от старых животных, которым для образования монослоя было необходимо более длительное культивирование.

Возраст животных	День культивирования
Концентрация кислорода	3	6	9
1 мес.	20%
5%
6-8 ме. с	20%
5%
>12 мес.	20%
5%

Рис.1. Первичная культура кмММСК крыс разного возраста. Фазовый контраст. Бар 100 мкм. Представлены микрофотографии в фиксированном поле зрения.

Рис.2. Число удвоений популяции ММСК в первичной культуре разновозрастных крыс, культивируемых при различном содержании кислорода.

достоверное отличие от кмММСК молодых крыс при 20% кислорода (р<0,05)

достоверное отличие от кмММСК молодых крыс при 5 % кислорода (р<0,05)

Оценка числа удвоений популяции с 3 по 6 сутки культивирования в первичной культуре, выявила снижение пролиферативной активности с возрастом. При сравнении пролиферативной активности клеток одной возрастной группы при 20% и 5% кислорода показано снижение числа удвоений в первичной культуре при пониженном содержании кислорода, причем этот эффект был более выражен с увеличением возраста (рис. 2).