Влияние возраста и пониженного содержания кислорода на функциональные свойства культивируемых мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга крыс (стр. 3 )

Пролиферативная активность культивируемых кмММСК. В условиях стандартного культивирования при 20% кислорода к третьему пассажу число удвоений в популяции кмММСК старых животных было достоверно ниже, чем у молодых крыс. Понижение концентрации кислорода в среде культивирования стимулировало пролиферативную активность во всех возрастных группах, в результате чего число удвоений на третьем пассаже приближалось к числу удвоений клеток молодых крыс (табл. 1).

Таблица 1. Число удвоений популяции кмММСК

Возраст	1 мес.	6-8 мес.	>12 мес.
Концентрация О2	20%	5%	20%	5%	20%	5%
Пассаж 1	3,5±0,2	4,1±0,1*	3,7±0,2٭	3,5±0,2	3,05±0,2*	3,8±0,2#
Пассаж 2	3,0±0,2	3,9±0,2*	2,8±0,2	3,8±0,2	2,5±0,3	3,2±0,2**#
Пассаж 3	3,9±0,2	4,4±0,1	3,6±0,2	4,0±0,2	2,1±0,45*٭	4,0±0,2#
Всего удвоений	10,4	12,4	10,1	11,3	7,6	11

* достоверное отличие от кмММСК молодых крыс при 20% кислорода (р<0,05)

** достоверное отличие от кмММСК молодых крыс при 5 % кислорода (р<0,05)

# достоверное отличие от кмММСК старых животных при 5 % кислорода (р<0,05)

٭ достоверное отличие от кмММСК старых животных при 20% кислорода (р<0,05)

Интересный результат был получен при расчете общего числа удвоений кмММСК за все время культивирования. Оказалось, что у молодых животных число удвоений при 5% О2 было больше на 20% по сравнению со стандартными условиями культивирования, у взрослых – только на 10%, а у старых – на 40%. Таким образом, культивирование при 5% О2 приводило к сглаживанию различий в пролиферативной активности между кмММСК животных разного возраста, наблюдаемые при 20% О2, причем особенно выраженным этот эффект был в группе старых крыс.

Колониеобразование. Одним из определяющих свойств ММСК костного мозга является их способность к формированию колоний, состоящих из потомков исходной клетки (КОЕ-Ф). Было показано, что в первичной культуре ММСК образовывали много плотных и крупных колоний. КмММСК старых животных при 5% кислорода также успешно образовывали клеточные колонии, однако они имели меньший размер и плотность (табл. 2) и сохраняли морфологические отличия, выявленные в первичной культуре. При дальнейшем субкультивировании в среде, содержащей 20% О2, среди клеток обеих групп КОЕ-Ф практически не выявлялись.

Таблица 2. Количество КОЕ-Ф среди кмММСК, полученных от молодых и старых крыс и культивируемых при различном содержании кислорода.

Концентрация О2	20% кислорода	5% кислорода
Группы Пассаж	1 месяц	>12 месяцев	1 месяц	>12 месяцев
0 пассаж
3 пассаж

Выявление «стареющих» кмММСК по активности бета-галактозидазы. Гистохимическое выявление бета-галактозидазы в кмММСК крыс разного возраста на следующий день после пассирования показало, что доля «стареющих» клеток (X-gal – положительных) у молодых животных была почти в 3 раза меньше, чем у взрослых и старых крыс. При 5% О2 процент X-gal – положительных кмММСК у взрослых крыс был существенно ниже, чем при 20% О2 и примерно таким же как у молодых. Эффект пониженного О2 на кмММСК у старых крыс был менее выраженным. При последующей экспансии при 20% О2 к 3 дню, когда клетки начинали пролиферировать, доля «стареющих» клеток в популяции от молодых животных продолжала оставаться невысокой, а среди клеток возрастных крыс существенно снижалась. При 5% О2 этот эффект был еще более заметен. В этом случае практически вдвое уменьшалась доля X-gal – положительных клеток и среди кмММСК от молодых крыс (рис. 3).

Рис. 3. Доля кмММСК крыс с выявленной активностью бета-галактозидазы.

Иммунофенотип культивируемых кмММСК. Для клеток-предшественников всех экспериментальных групп независимо от условий культивирования, была характерна экспрессия антигенов: CD90, CD54, CD44, CD73. КмММСК были отрицательны по CD45 и CD11b (табл. 3).

Таблица 3. Иммуннофенотип ММСК костного мозга разновозрастных животных

Возрастные группы	1 месяц	6-8 месяцев	>12 месяцев
О2 Антиген	20% О2	5% О2	20% О2	5% О2	20% О2	5% О2
CD90	99,9±0,1	99,8±0,1	99,9±0,1	99,9±0,1	99,0±0,9	99,8±0,2
CD54	99,1±0,1	98,4±0,7	99,0±0,3	99,7±0,1	96,7±2,3	96,1±3,4
CD44	97,3±1,0	97,4±1,0	97,3±1,8	97,4±1,0	97,3±1,8	97,3±0,7
CD73	97,3±1,0	97,7±1,0	97,1±1,6	98,7±0,7	97,3±1,8	97,3±0,3
CD11b	3,7±0,5	2,3±0,1	97,1±1,6	4,2±0,1	2,2±0,8	2,7±1,1
CD45	1,5±0,5	0,3±0,1	4,7±1,7	2,7±1,4	0,6±0,4	0,8±0,4

Потенциал дифференцировки. При 20% О2 доля кмММСК со спонтанной активностью щелочной фосфатазы (начальные этапы остеогенной дифференцировки) была существенно ниже для взрослых и старых животных, индукция остеодифференцировки несколько стимулировала увеличение доли таких клеток у молодых и взрослых крыс, но не влияла на кмММСК старых животных (Рис.4). При 5% О2 доля спонтанно дифференцированных клеток среди кмММСК молодых крыс была ниже, чем при 20% О2, а у взрослых и старых животных, наоборот, выше, чем при 20% О2. Индукция дифференцировки при 5% О2 привела к увеличению доли кмММСК с активностью щелочной фосфатазы практически до уровня молодых животных.

Рис.4. Процент клеток, содержащих щелочную фосфатазу

достоверное отличие от кмММСК молодых крыс при 20% кислорода (р<0,05)

В кмММСК всех исследуемых групп не было обнаружено спонтанно образованных липидных капель (адиподифференцировка). После индукции в клетках молодых крыс, культивируемых при 20% кислорода, доля кмММСК, содержащих липидные включения, была минимальна. При 5% кислорода значительно снижалось число таких клеток в группах взрослых и старых животных, причём максимальное снижение наблюдалось в группе старых животных. Вместе с тем, при пониженном содержании кислорода было выявлено увеличение процента клеток с липидными включениями у кмММСК молодых животных (рис. 5).

Рис.5. Процент кмММСК, содержащих липидные капли в цитоплазме

достоверное отличие от кмММСК молодых крыс при 20% кислорода (р<0,05)

достоверное отличие от кмММСК 6-8 месячных крыс при 20% кислорода (р<0,05)

достоверное отличие от кмММСК старых крыс при 20% кислорода (р<0,05)

Репаративный потенциал кмММСК крыс разного возраста. Важным показателем функциональной активности ММСК является их влияние на процессы регенерации. Для того, чтобы сравнить репаративный потенциал кмММСК от молодых и старых животных, была проведена оценка эффективности формирования костной мозоли на месте экспериментального перелома малоберцовой кости крыс после введения культивируемых при 20% О2 кмММСК от крыс разного возраста (рис. 6).