ПасторексТМ менингитис

ПАСТОРЕКСТМ МЕНИНГИТИС

25 тестов

61607 61611 61616

61608 61613 61618

61610 61614 61717

ОПРЕДЕЛЕНИЕ РАСТВОРИМОГО АНТИГЕНА И ИДЕНТИФИКАЦИЯ NEISSERIA MENINGITIDIS A, C, Y/W 135, B/E.COLI K1, HAEMOPHILUS INFLUENZAE b, STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE, STREPTOCOCCUS B

IVD

1-  КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ

Бактериальный менингит – инфекция мозговой оболочки и главными возбудителями заболевания являются: Neisseria meningitis, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae тип b и Streptococcus группы В.

Менингит – серьезное состояние, поэтому важно диагностировать инфекцию быстро для того, чтобы начать адекватное лечение. Общепринятая методика идентификации культуры, даже не смотря на обязательную антибиотикограмму и подтверждение диагноза, медленная и может давать ложно отрицательные результаты если образец транспортировался и хранился при неудовлетворительных условиях или если антибиотикотерапия была начата до отбора образца.

Иммунологические методы для определения растворимых антигенов выделенных возбудителями заболевания в биологические жидкости, например спинно-мозговую жидкость, мочу, сыворотку в течении инфекции, дают возможность более быстрой диагностики. Растворимый антиген, который может определяться с помощью этого набора – это полисахарид, специфичный для определенных серогрупп или серотипов: Streptococcus pneumoniae (83 типа); Haemophilus influenzae тип b, Neisseria meningitides группа А, группа B/E. coli K1, группа С, группа Y/W 135 и Streptococcus группы B.

Полисахаридный антиген специфичный к менингококкам серогруппы В только очень незначительно антигенен и всегда очень трудно получить воспроизводимые кроличьи антитела особенно ориентированные против этого антигена. Технология моноклональных антител использованная для подготовки специфических бактериальных полисахаридных антигенов делает возможным получение моноклональных мышиных антител способных специфически и воспроизводимо распознавать полисахаридный антиген менингококков серогруппы В.

Этот полисахаридный антиген специфичный для менингококков серогруппы В – идентичен полисахаридному антигену обнаруженному у E. coli K1. Эта антигенная гомология между менингококками B и E. coli K1 позволяет диагностику E. coli менингитов у новорожденных, из которых около 80 % – штамм К1.

Необходимо отметить, что E. coli и стрептококки группы В являются основными бактериями ответственными за менингит у новорожденных и недоношенных детей, и эта менингококковая чрезвычайно редка в этой возрастной группе.

2-  ПРИНЦИП МЕТОДА

Антиген, содержащийся в протестированном образце, идентифицируется с использованием латексных частиц, которые покрыты специфичными гомологичными антителами. В присутствии гомологичного антигена латексные частицы агглютинируют. В отсутствии антигена, они остаются в виде гомогенной суспензии.

3-  ОПИСАНИЕ

1. НАБОР ПАСТОРЕКСТМ МЕНИНГИТИС, 25 тестов, каталожный номер 61607, состоит:

·  Реагент 1 (R1): N. meningitidis B/E.coli K1

1 флакон с 0,4 мл красного латекса сенсибилизированного мышиными моноклональными антителами, специфичными к N. meningitidis групп B/E.coli K1.

·  Реагент 2 (R2): ): N. meningitidis B/E.coli отрицательный контроль

1 флакон с 0,4 мл красного латекса сенсибилизированного мышиными моноклональными антителами специфичными к столбнячному токсину.

·  Реагент 3 (R3): H. influenzae b

1 флакон с 0,4 мл белого латекса сенсибилизированного кроличьими антителами специфичными к H. influenzae тип b.

·  Реагент 4 (R4): S. pneumoniae

1 флакон с 0,4 мл зеленого латекса сенсибилизированного кроличьими антителами специфичными к S. pneumoniae

·  Реагент 5 (R5): Стрептококки группы В.

1 флакон с 0,4 мл желтого латекса сенсибилизированного кроличьими антителами специфичными к стрептококкам группы В.

·  Реагент 6 (R6): N. meningitidis A

1 флакон с 0,4 мл синего латекса сенсибилизированного кроличьими антителами специфичными к N. meningitidis группы A

·  Реагент 7 (R7): N. meningitidis С

1 флакон с 0,4 мл красного латекса сенсибилизированного кроличьими антителами специфичными N. meningitidis группы С

·  Реагент 8 (R8): N. meningitidis Y/W 135

1 флакон с 0,4 мл розового латекса сенсибилизированного кроличьими антителами специфичными к N. meningitidis Y/W 135

·  Реагент 9 (R9): Отрицательный поливалентный контроль

1 флакон с 0,4 мл фиолетового латекса сенсибилизированного IgG иммуноглобулинами от неиммунизированных кроликов

·  Реагент 10 (R10): Поливалентный положительный контроль

Положительный контроль: лиофильно высушенный антигенный экстракт восстанавливается 1 мл стерильной воды. Содержит полисахаридные антигены N. meningitidis A, C, B, Y/W135, H. influenzae b, стрептококков группы В и S. pneumoniae. Объем достаточный для 20 реакций.

Все реагенты содержат 0,02 % тимеросала.

Реагенты R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9 содержат менее чем 0,1 % азида натрия.

·  Одноразовые агглютинационные карты.

·  Одноразовые палочки для перемешивания.

2. ПАСТОРЕКСTM МЕНИНГИТИС ИНДИВИДУАЛЬНЫЕ ЛАТЕКСНЫЕ ТЕСТЫ (25 тестов в каждом):

·  Отдельный латексный тест (без контроля)

- N. meningitidis A (R6) каталожный номер 61608

- N. meningitidis С (R7) каталожный номер 61610

- N. meningitidis B/E.coli K1 (R1) каталожный номер 61611

- Стрептококки группы В (R5) каталожный номер 61613

- Streptococcus pneumoniae (R4) каталожный номер 61614

- Haemophilus influenzae b (R3) каталожный номер 61616

·  ПАСТОРЕКСTM МЕНИНГИТИС контроль

Набор контрольных реагентов для отдельного латексного

теста (для 2×25 тестов) каталожный номер 61618

- 2 флакона с капельницей с 0,4 мл поливалентного отрицательного контроля (R9)

- 2 флакона лиофильно высушенного поливалентного положительного контрля (R10) восстанавливается 1 мл стерильной воды

- 2 флакона с капельницей с 0,4 мл отрицательного контроля для N. meningitidis B/E.coli K1 (R2)

-одноразовые агглютинационные карты

-одноразовые палочки для перемешивания.

3. ПАСТОРЕКСTM МЕНИНГИТИС разбавитель

1 флакон с 0,4 мл разбавителя

для обработки сыворотки каталожный номер 61717

4- ХРАНЕНИЕ

Все реагенты (даже открытые) стабильны до окончания срока годности указанного на этикетке, если хранились при +2-80С при отсутствии микробной контаминации.

Восстановленный поливалентный положительный контроль R10 стабилен 1 месяц при +2-80С (при отсутствии микробной контаминации) или дольше, если аликвотирован и сразу заморожен при -200С.

Флаконы с латексными реагентами хранить вертикально.

ЛАТЕКСНЫЕ РЕАГЕНТЫ НЕ ЗАМОРАЖИВАТЬ.

5- НЕОБХОДИМЫЕ, НО НЕ ВХОДЯЩИЕ В НАБОР МАТЕРИАЛЫ

·  Пипетки для внесения 1 капли (40-50 мкл) образца

·  Гемолизные или эппендорфные пробирки

·  Сухо-воздушный инкубатор или водяная баня на 1000С.

·  Центрифуга для гемолизных или эппендорфных пробирок.

·  Бак для дезинфекции

·  Стерильная дистиллированная вода, стерильный физ. раствор или разбавитель (каталожный номер 61717).

6- МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ

Качество результатов зависит от соблюдения правил надлежащей лабораторной практики.

·  Все реагенты и образца должны использоваться при комнатной температуре при 18-250С.

·  Не касаться реакционной поверхности агглютинационных карт.

·  Менять пипетки или одноразовые наконечники для каждого тестируемого образца.

·  Перемешивать флаконы с латексом перед использованием.

·  Вытирать наконечники реагентных флаконов в капельницей для того чтобы получать хорошо калиброванные капли.

·  Держать флакон с реагентом вертикально, чтобы осадить капли.

·  Менять палочки для перемешивания для каждой реакции.

·  Выкидывать все использованные одноразовые материалы в автоклавируемый мешок для отходов или дезинфекционную ванну.

·  Поливалентный положительный контроль восстановить дистиллированной стерильной водой, свободной от микробной контаминации.

ИНСТРУКЦИИ ПО ГИГИЕНЕ И ТЕХНИКЕ БЕЗОПАСНОСТИ

Всегда соблюдайте правила техники безопасности и преупредительные меры относящиеся к обеспечению безопасности при работе с микроорганизмами..

·  Все отобранные образцы должны считаться потенциально инфекционными

7-ПРОЦЕДУРА: СМЖ, СЫВОРОТКА, МОЧА

Образцы

Образцы должны обрабатываться в максимально короткий срок после отбора. Если это не возможно, они могут храниться несколько часов при +2-80С, или дольше при -200С (в этом случае, хранить только супернатант при -200С после центрифугирования). Исключить повторное замораживание/оттаивание. Бактериологическое исследование (культура) должно выполняться в первую очередь для того чтобы исключить контаминацию образца. Минимальный объем образца для тестирования с латексным набором – 0,5 мл.

ПОДГОТОВКА КЛИНИЧЕСКИХ ОБРАЗЦОВ

ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: когда используется водяная баня, используйте герметичные пробирки, чтобы сохранить воду от проникновения в пробирки. Если возможно, используйте сухо-воздушный инкубатор.

а) СМЖ (спинномозговая жидкость)

Если СМЖ очень мутная или содержит красные кровяные клетки, отцентрифугируйте ее 5 мин при 350 g и отберите супернатант.

·  Прогрейте образцы 3 мин при 1000С (в суховоздушном инкубаторе или на водяной бане). Дайте образцу охладиться до комнатной температуры, затем отцентрифугируйте 5 мин при 3000 g или отфильтруйте через 0,45 мкм фильтр.

б) Сыворотка

·  Добавьте 3 объема (1,5 мл) разбавителя (каталожный номер 61717) к одному объему (0,5 мл) сыворотки.

·  Прогрейте 3 минуты при 1000С на водяной бане или в суховоздушном инкубаторе.

·  Центрифугируйте 5 мин при 3000 g.

ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Не используйте образцы плазмы. Погрешность из-за перегрузки альбумином, липидами, гемоглобином и билирубином не определялась. Наилучшие результаты получаются при использовании свежей сыворотки.

в) Моча

Для того чтобы увеличить концентрацию антигена, перед тестированием, образец может быть сконцентрирован в 25 раз на Аmicon тип B15 мембране (www. /amicon).

·  Нагревать мочу 3 мин при 1000С (суховоздушный инкубатор или водяная баня).

·  Центрифугировать 5 мин при 3000 g или фильтровать через 0,46 мкм фильтр

Б) ПРОЦЕДУРА ТЕСТИРОВАНИЯ

·  Внести каплю (40-50 мкл) супернатанта предварительно подготовленного образца в каждый круг аглютинационной карты.

·  Осторожно перемешать флаконы с латексными реагентами.

·  Держа флакон вертикально, внести по одной капле каждого латексного реагента на аглютинационную карту следующим показанным образцом внесения: R9, R6, R7, R1 и R2 в белые круги и R8, R3, R4 и R5 в черные круги.

·  Перемешать латексные реагенты и образцы палочкой, меняя палочки для каждого латекса.

·  Вращать карты осторожно (~ 120 об/мин) 10 мин и смотреть за появлением какой-либо агглютинации, видимой невооруженным глазом в пределах 10 мин (перемешивающее устройство орбитального типа может использоваться при скорости ~ 120 об/мин).

8-ПРОЦЕДУРА: КУЛЬТУРЫ КРОВИ

Для предварительной идентификации проведите исследование морфологии и окрашивание по Грамму

·  Возьмите 1-2 мл положительной культуры крови

·  Центрифугируйте 5 мин при 2000 g

·  Внесите одну каплю (40-50 мкл) супернатанта в каждый круг на агглютинационной карте, соответственно латексным реагентам, которые необходимо протестировать в соответствии с окрашиванием по Грамму.

·  Осторожно перемешайте латексные реагенты отобранные для теста.

·  Держа флаконы вертикально, внести по одной капле каждого выбранного латексного реагента сбоку от капель супернатанта.

·  Перемешать латексные реагенты и образцы используя полочки. Меняя палочку для каждого латекса.

·  Вращать карту при ~ 120 об/мин в течение 5 мин. Через 5 мин контролировать появление агглютинации.

Некоторые среды культуры крови могут давать неспецифические реакции или проблемы с интерпретацией. В качестве отрицательного контроля используйте культуры крови, иннокулированные стерильной кровью или другими организмами, чем те, которые определяются ПАСТОРЕКСТМ Менингитис.

9-ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ

ПОЛОЖИТЕЛЬНАЯ РЕАКЦИЯ

Положительная реакция показывается хорошей агглютинацией, видимой невооруженным глазом, в сравнении с отрицательным контролем.

Интенсивность агглютинации и время появления зависит от концентрации антигена в тестируемом образце.

Несоответствие между положительным антигенным тестом и отрицательной культурой может объясняться отсутствием живых бактерий в культивируемом образце (лечение антибиотиками начатое до отбора образца или условия транспортировки не поддерживающие выживания неустойчивых бактерий).

В большинстве случаев, положительная реакция с анти - N.meningitidis B/E.coli K1 латексом у новорожденных или недоношенных детей показывает инфекцию E.coli K1. У более старших пациентов, менингококки группы В более вероятны. Культивирование образцов должно подтвердить диагноз.

ОТРИЦАТЕЛЬНАЯ РЕАКЦИЯ

Гомогенная суспензия без комочков.

НЕИНТЕРПРЕТИРУЕМЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

Реакция неинтерпретабельна, если образец агглютинирует с латексом отрицательного контроля (R2 или R9) и/или с более чем одним латексным реагентом из набора). В этом случае рекомендуется повторить тест с другим образцом и подождать результатов культивирования. (Очень редко, инфекция может быть вследствие двух разных бактериальных видов).

10-ПРОЦЕДУРА: ИДЕНТИФИКАЦИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ШТАММОВ ВЫДЕЛЕННЫХ НА АГАРЕ (Колонии из свежей и чистой культуры).

Латекс Y/W 135 не может использоваться для этой идентификации бактериальных штаммов. Чтобы определить эти группы рекомендуется использовать традиционные антисыворотки (набор Y, W135, 29E: каталожный номер 58704 3×1 мл).

Для предварительной ориентации перед выполнением теста.

·  Провести исследование морфологии и окрашивание по Грамму.

·  Для Грам-отрицательных бактерий – оксидазный тест (положительный для N. meningitidis, отрицательный для E. coli К1).

·  Для Грам-положительных кокков выполнить каталазный тест (не тестировать каталазо-положительные штаммы).

Не имеющие капсулу S. pneumonia и Haemophilus influenzae штаммы не могут идентифицироваться этим методом.

а) Идентификация: N. meningitidis (А, В, С только), H. influenzae, E. coli, S. pneumoniae.

·  Внести 30 мкл каплю стерильного физ. раствора в круг на агглютинационной карте.

·  Образец:

-Для N. meningitidis, Haemophilus influenzae и E. coli, количество эквивалентное 1 мкл петле, в которой максимум 2-3 колонии.

- Для Streptococcus pneumoniae, количество эквивалентное 5 мкл петле, в которой минимум 10-12 колоний.

·  Аккуратно эмульгируйте собранные колонии таким образом, чтобы получить гомогенную суспензию.

·  Осторожно перемешайте флакон с латексным реагентом выбранным для идентификации, держа флакон вертикально, внесите одну каплю этого латекса сбоку от капли бактериальной суспензии.

·  Перемешайте латекс и суспензию используя палочку.

·  Вращайте карту (~ 120 об/мин).

·  Наблюдайте за появлением четкой агглютинации менее чем через 2 минуты.

·  Подтвердите идентификацию видов используя традиционные биохимические тесты.

б) Идентификация: стрептококки группы В (β-гемолитические колонии)

·  Суспендируйте 5 колоний в 2 мл в бульоне Тодда-Геввита.

·  Инкубируйте при 370С на водяной бане 2-3 часа.

·  Центрифугируйте 5 минут при 3000 g

·  Внесите одну каплю (40-50 мкл) супернатанта в круг на агглютинационной карте.

·  Осторожно перемешайте флакон с латексным реагентом, держа флакон вертикально, внесите одну каплю этого латекса сбоку от капли супернатанта.

·  Перемешайте латекс и образец используя палочку.

·  Вращайте карту (~ 120 об/мин).

·  Наблюдайте появление четкой агглютинации в течении менее чем 1 минуты.

·  Подтвердите идентификацию этих видов используя традиционные биохимические тесты. Для прямой экстракции из изолированных колоний, используйте набор ПАСТОРЕКСТМ СТРЕП (каталожный номер 61721).

11-КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА ТЕСТА

Латексные реагенты должны быть полностью гомогенными после перемешивания.

Положительный поливалентный контроль R10 используется, чтобы контролировать иммунореактивность каждого латекса.

·  Чтобы выполнить контроль качества теста, внесите одну каплю (40 мкл) положительного контроля (R10) в каждый круг на агглютинационной карте.

·  Осторожно перемешайте флакон с латексным реагентом.

·  Держа флакон вертикально, внесите одну каплю каждого латексного реагента на агглютинационную карту следующим показанным образом: R9, R6, R7, R1 и R2 в белые круги и R8, R3, R4 и R5 в черные круги.

·  Перемешайте латексные реагенты и положительный контроль используя палочку, меняя палочку для каждого латекса.

·  Вращайте карту при ~ 120 об/мин 10 минут. Через 10 минут контролируйте появление агглютинации невооруженным глазом (сравните тестовые латексные реакции с такими же для латексного отрицательного контроля).

Интенсивность агглютинации и скорость появления зависит от антиген-антительной авидности. В результате реакции, наблюдаемые для каждого латекса, различны. Агглютинация латекса N. meningitidis B/E.coli K1более мелкая, чем у других.

·  Физ. раствор или разбавитель (каталожный номер 61717) контролируют отсутствие неспецифической агглютинации каждого латекса.

Чтобы выполнить этот тест контроля качества, физиологический раствор или разбавитель R11 (каталожный номер 61717)используются в соответствии с протоколом для поливалентного положительного контроля (см. предыдущую процедуру).

·  Латексные реагенты не должны использоваться, если они не агглютинируют с поливалентным положительным контролем (R10), или когда они неспецифично агглютинируют с физ-раствором или разбавителем (каталожный номер 61717) (это возможно при неправильных условиях хранения набора или при контаминации латексного реагента).

12-КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА ПРОИЗВОДИТЕЛЯ

Все производимые реагенты изготавливаются в соответствие с системой качества компании «Био-Рад», начиная с приема сырья и до продажи продукта. Любой лот поступает на рынок только после прохождения строгой процедуры контроля на предмет соответствия определенным критериям. Вся информация относительно продукта и его контроля хранится в компании «Био-Рад».

13 – ПАРАМЕТРЫ ТЕСТ-СИСТЕМЫ

ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ

Чувствительность каждого реагента набора определялась при анализе :

·  Очищенных антигенов в растворе

·  Клинических образцов цереброспинальной жидкости, наличие возбудителя в которых определялось рутинными методиками (микроскопирование, культивирование)

·  Штаммы культивированные на среде Мюллера-Хинтона, шоколадном агаре с добавкой PVS, агаре Колумбия c 5% кровью барана.

Антиген или бактерия, обнаруженные в образце	Раствор антигена (NaCl, 9°¤oo )	Спинно-мозговая жидкость	Штаммы
	Предел определенной концентрации	Кол-во исследов. образцов	Кол-во положит. латексных тестов	Кол-во исследов. образцов	Кол-во положит. результатов
N. meningitidis A	2,5 нг/мл	12	12	22	22
N. meningitidis В / E.coli K1	62,5 нг/мл	Нет данных	9 1	9 1
N. meningitidis С	2,5 нг/мл	3	3	16	16
N. meningitidis Y	5 нг/мл	Нет данных	-	-
N. meningitidis W	2,5 мкг/мл	Нет данных	-	-
S. pneumoniae	95 нг/мл	24	22	15	15
Streptococcus B	20 нг/мл	1	1	15	15
H. influenzae В	0,1 нг/мл	34	33	17	17

СПЕЦИФИЧНОСТЬ

Специфичность каждого реагента набора определялась при анализе :

·  Стерильной СМЖ(а) и СМЖ контаминированной бактериями, вызывающими менингит, но отличными от определяющихся данным латексным тестом (б)

·  Колонии родов Neisseria, Branhamella, Acinetobacter, Streptococcus, Klebsiella, Haemophillus, Escherichia coli не К1, Pseudomonas которые тестировались латексом сенсибилизированным к другим возбудителям.

Латексный тест	Стерильная СМЖ (а)	Контаминированная СМЖ(б)	Штаммы (с)
	Количество исследованных образцов	Количество отрицат. результатов	Количество исследов. образцов	Количество отрицат. результатов	Количество исследов. образцов	Количество отрицат. результатов
N. meningitidis A	52	52	50	50	122	122
N. meningitidis В/	12	12	Нет данных	53	48*
E. coli K1
N. meningitidis С	52	52	56	56	127	127
S. pneumoniae	60	60	39	39	33	33
Streptococcus B	49	49	58	58	17	17
H. influenzae В	61	61	32	32	31	31
	Неисследованная СМЖ пациентов
	Количество исследов. образцов	Количество отрицат. результатов
N. meningitidis Y/W135	40	40	-	-

*1/1 штамм штамм Neisseria flavescens, 2/4 Klebsiella pneumonia, 2/5 Acinetobacter дали неспецифические реакции.

КУЛЬТУРЫ КРОВИ

Характеристики PASTOREXTM MENINGITIS исследовались на культурах крови. Результаты этих исследований таковы:

·  Чувствительность: 100% (4/4 включая 2 штамма S. pneumoniae и 2 штамма Streptococcus B )

·  Специфичность: 100% (37/37) Для реагентов R3, R4,R5,R6,R7 и R8.

·  Специфичность 97,5 % (39/40) Для реагента R1.

Из 3 кровяных культур с Klebsiella pneumoniae, 1 дал не специфическую реакцию.

14 – ОГРАНИЧЕНИЯ МЕТОДА

·  Во многих случаях иммунологический латексный тест позволяет провести предварительное диагностирование организма. Однако концентрация антигена в образце может быть ниже предела обнаружения латекса и давать отрицательный результат. В этом случае необходимо повторить исследование через некоторое время.

·  Этот метод не может заменить культуральный метод с последующей постановкой антибиотикограммы.

·  Принимая во внимание разнообразие сред для выращивания кровяных культур, разработчики не гарантируют стабильность результатов на всех средах (например 7-D).

·  Клинические и библиографические данные относительно определения антигенов в сыворотке и моче с использованием латексных реагентов ограничены в настоящее время.

·  Несколько примеров неродственных бактерий обладающих сходными антигенами сообщались. Возможность перекрестной реакции должна всегда учитываться (1, 4, 5).

·  Окончательный диагноз, как и все лабораторные диагнозы, не может основываться на результатах одного единственного теста, а на общем представлении всех клинических данных и биохимических, цитологических и иммунологических результатов.

·  Определение растворимого антигена в культуре крови, так же хорошо как идентификация штаммов, выделенных на агаре, должно заканчиваться видовой идентификацией бактериального штамма.

15-БИБЛИОГРАФИЯ

См. французскую версию.