Применение токсикологических методов в изучении механизмов резистентности к инсектицидам у насекомых (стр. 2 )

При изучении механизмов устойчивости насекомых к ФОС, содержа­щим P=S связь, необходимо учитывать, что увеличение активности ММ может быть причиной как снижения токсичности инсектицида в резуль­тате ведущих к детоксикации химических превращений, так и ее увели­чения за счет метаболической активации тиофосфата в более токсичную оксоновую форму (P=S→P=O) [29]; конечный результат чаще всего определяется наложением обоих этих процессов. Надежные данные о роли ММ в резистентности в таких случаях можно получить при проведении токсикологических испытании с использованием тионовой и оксоновой форм инсектицида, синергизируемых ингибитором ферментатив­ной активности. Так, на резистентной популяции жука Oryzaephilus stirnamensis ППБ снижает ЛД50 фенитротиона в 40 раз, а фенитрооксона - в 34 раза [30]; следовательно, увеличение активности ММ обеспечивает в данном случае метаболическую дстоксикацию инсектицида. Pilz, Pfeiffer, Otto [31] считают возможным оценить способность паутинного клеща Teiranychus urticae превращать диметоат в диметоксон сравне­нием летальных доз обоих инсектицидов как на чувствительной, так и на резистентной популяциях, однако возможность участия гидролаз и трансфераз в детоксикации ФОС делает их вывод сомнительным. Дей­ствительно, летальные дозы малатиона и малооксона на клопе-назем­нике Oncopeltus fasclatus находятся в соотношении 4: 1, однако их сме­си с ингибитором эстераз 1-нафтил-N-пропилкарбаматом равнотоксичны [24].

Для оценки эффективности синергистического действия ингибиторов активности ферментов детоксикации используют показатель КСД {ко­эффициент синергистического действия), который представляет отноше­ние среднелетальных доз инсектицида (I) в присутствии синергиста (S) и без него:

КСД = ЛД50 (I) / ЛД50 (I + S)

В рамках такого подхода Brattsten и Metcalf [32, 33] определены токсичность карбарила и синергизм с ППБ у 70 видов насекомых из разных родов и порядков. Установлено, что показатель КСД варьировал от 1 до 400, при этом не наблюдалась корреляция токсичности карба­рила со значением КСД. Такие различия в чувствительности насекомых к карбарилу и вариации КСД авторами объясняются как различия в активности многофункциональных монооксигеназ, которая снижается под действием ППБ; следовательно, величина КСД должна отражать уровень активности ферментов детоксикации и изменение активности под действием ингибиторов. Однако в ряде работ соответствия между изменениями в чувствительности насекомых к инсектицидам, величиной КСД и активностью ферментов детоксикации обнаружено не было [34-36]. Пытаясь найти корреляции между ЛД50 инсектицидов и изменения­ми в их токсичности под влиянием ингибиторов активности ферментов, Brindley [37] для оценки вклада ферментов детоксикации (на примере монооксигеназ) предложил использовать показатель СР (синергистическая разность):

СР = ЛД50 (I) - ЛД50 (I + S)

Этот показатель, по мнению Brindley, должен отражать токсичность инсектицида в условиях, когда активность мопооксигеназ ингибируется практически полностью. При исследовании влияния ППБ на токсичность карбарила у пчелы-листорезки Megachile pacifica и у популяций клопа рода Labops экспериментальные данные, представленные в координатах ЛД50—СР, показали хорошее соответствие [37, 38]. В этих же работах был предложен еще один параметр - «процент синергизма» (%С), кото­рый должен отражать степень зависимости детоксикации конкретного инсектицида от активности определенной ферментной системы (на при­мере ММ):

%C = 100 [ЛД50 (I) - ЛД50 (I + S)] / ЛД50 (I)

Для возможности использования этого параметра сделано сущест­венное допущение, а именно что ингибитор является специфическим для данной ферментной системы и практически полностью тормозит ее ак­тивность. Подобная ситуация реализуется, по-видимому, достаточно ред­ко, и поэтому в ряде случаев применение показателя %С не позволяет правильно интерпретировать полученные результаты, что доказано на насекомых, обладающих резистентностью с заведомо установленным ме­ханизмом.

В поисках адекватного параметра для доказательства участия фер­ментов в резистентности. Brindley ввел несколько дополнительных пара­метров: «логарифм процента синергизма» (L%C), «относительный лога­рифм процента синергизма» (0%С) и с их помощью проанализировал собственные и литературные данные [39, 40]. Тем не менее, неоднознач­ность в интерпретации полученных результатов возникает и при исполь­зовании новых параметров. Это можно объяснить, с одной стороны, тем, что в большинстве случаев в основе резистентности лежит несколько, в том числе и неметаболических, механизмов, которые могут взаимно усиливать друг друга. С другой стороны, ингибиторы in vitro могут тор­мозить активность одновременно нескольких ферментных систем.

Правильная процедура применения ингибиторного анализа требует исключения влияния синергиста на проницаемость инсектицида через внешние покровы насекомого. Добиться этого можно двумя способами: десинхронизацией и делокализацией нанесения обоих активных ингре­диентов. При изучении потенциирования пиретроидов различными синергистами против гусениц хлопковой листовой египетской сов­ки Spodoptera littoralis Riskallah с соавт. по­казали [41], что КСД значимо увеличива­ется, если синергист и инсектицид наносить на различные участки поверхности насеко­мых. Поскольку большинство детоксицирующих ферментов у насекомых в имагинальной стадии развития локализованы в жировом теле и мальпигиевых сосудах брюшка [42], синергист при такой процедуре нано­сят на вентральную поверхность брюшка, а инсектицид - между мезо - и метатораксиальными конечностями [24]. Для гусениц при делокализации и инсектицид и синергист наносят на дорзальную поверхность, ин­сектицид на торакс, а синергист - на брюшко [24]. Не менее целесооб­разно применение контактного метода, в котором предварительно топикально обработанных синергистом насекомых помещают в сосуд, внут­ренняя поверхность которого покрыта тонким слоем инсектицида.

Показано, что синергистический эффект зависит также от интервала между нанесением синергиста и инсектицида. Так, Al-Badry и Knowles показали [43], что снижение скорости проникновения инсектицида при одновременном нанесении хлорпирифоса с диалкилфталатами на имаго М. domestica приводит к антагонизму, а нанесение диалкилфталата за 30 мин до инсектицида - к синергизму. Многие исследователи для устра­нения влияния синергиста на проницаемость инсектицида используют 0,5-4-ч (см. например [36]) или даже 16-24-ч [14] предобработку на­секомого синергистом. Однако такая процедура может привести к непредсказуемым результатам. Синергистический эффект, который прояв­ляется при одновременном нанесении ППБ и авермектина на гусениц совки Spodoptera eridania, исчезает при 2-ч предобработке ППБ [44]. Аналогичный результат получен при изучении влияния диэтилмалеата на токсичность фосфорорганических инсектицидов на М. domestica: синергистический эффект проявляется только при минимальном интервале между нанесением синергиста и инсектицида [16].

Кроме топикального и контактного в ингибиторном анализе может применяться и кишечный метод введения синергиста и инсектицида. В ряде случаев синергистический эффект можно получить только с ис­пользованием этого метода [45, 46]. Нужно отметить, что летальная доза инсектицида при кишечном методе введения значительно превыша­ет таковую, полученную при контактном методе [46].

Одним из наиболее спорных вопросов при проведении ингибиторного анализа является определение оптимального соотношения инсектицида и синергиста (I/S). Совершенно очевидно, что оптимальной дозой синергиста будет минимальное его количество, вызывающее максимальный синергистический эффект. Такая доза (So) является асимптотической на графике зависимости смертности от количества инсектицида и синергиста (рисунок) [47].

В тех случаях, когда соотношение I/S выше оптимума, наносимый синергист будет не полностью блокировать активность фермента, ответст­венного за детоксикацию инсектицида; если же это отношение ниже оп­тимального, синергист может препятствовать или задерживать проникновение инсектицида.

На практике многие исследователи, чтобы избежать процедуры оп­ределения So, считают возможным применять синергист в фиксирован­ных максимально сублетальных концентрациях Smax, исключая при этом влияние синергиста на проницаемость инсектицида делокализацией или десинхронизацией их нанесения [23, 48]. Однако даже Smas синергиста не может обеспечить полного подавления активности ферментов детоксикации: так, в этих условиях метаболизм байгона в присутствии ППБ у резистентной популяции мух М. domestica снижается только на 16% [49]. Большие дозы синергиста могут, вероятно, оказать влияние на транспорт инсектицида через гемолимфу, либо неселективно ингибировать активность ферментов детоксикации: известно, что ППБ in vitro в концентрациях 10-4 М ингибирует активность неспецифических эстераз из брюшек М. domestica примерно в той же степени, что и бутифос [18]. Кроме того, ППБ, в сублетальных концентрациях проявляющий антифидантные свойства [50], способен вызвать синергистический эффект, не связанный с метаболизмом инсектицидов [51]. Таким образом, субле­тальная доза синергиста означает, по-видимому, не полное или даже максимально возможное подавление активности ферментов детоксика­ции, а, скорее всего, баланс во влиянии синергиста на все возможные факторы, определяющие токсичность инсектицида для насекомых. До­казательство полного ингибирования активности ферментной системы может быть корректным лишь в том случае, когда оно подкреплено дан­ными об отсутствии метаболизма инсектицида.

Значительное число исследователей при проведении ингибиторного анализа предпочитают использовать определенные фиксированные соот­ношения I/S (обычно в пределах 1:1-1:10) [19, 46, 52]. Этот метод, применяемый в основном со средне - и низкотоксичными инсектицидами, обладает практически теми же достоинствами и недостатками, что и приведенный выше; для высокотоксичных инсектицидов неполное ингибирование фермента компенсируется исключением побочных механиз­мов. Часто различия в методике анализа совершенно непринципиальны: так, Smax ППБ для колорадского жука Leptinotarsa decetnlineata (100 мг/г) [40] примерно равно значению So с перметрином и соответ­ствует I/S=l:4 [53]. Следует заметить, что эти нюансы могут быть зна­чимы лишь в тех случаях, когда роль ингибируемых ферментов в устой­чивости вредителя к инсектициду относительно невелика и КСД не пре­вышает 5. Если же увеличение активности ферментов детоксикации при­водит к достаточно высокому уровню резистентности, то синергистическое действие хорошо проявляется даже при обработке насекомых рас­творами смеси инсектицида с синергистом [28].