Практическая часть
1.Определение резистентности спермиев к многократному разбавлению проводится по методу Смирнова – Поставной.
Порядок работы
Работу проводят при температуре 18-220С. Во флакон № 1 микропипеткой вносят 0,02 мл испытуемой спермы и малыми порциями добавляют 10 мл 1%-ного раствора хлористого натрия, перемешивая смесь круговыми движениями флакона. Остатки спермы из канала микропипетки смывают во флакон. Стеклянной палочкой каплю смеси наносят на предметное стекло и исследуют на активность спермиев под малым увеличением микроскопа без покровного стекла.
Если спермии неподвижны, то резистентность менее 500 (10 мл : 0,02 мл = 500).
При наличии спермиев с поступательным движением 0,5 мл смеси из флакона №1 переносят во флакон № 2 и доливают 0,5 мл 1%-ного раствора хлористого натрия. Каплю исследуют на активность спермиев. Если спермии мертвые, резистентность не более 1000.
Если спермии двигаются поступательно, во флакон № 2 наливают еще 1 мл раствора хлористого натрия. При добавлении каждой новой порции раствора резистентность увеличивается на 1000. Добавление раствора проводят до тех пор, пока не прекратится поступательное движение спермиев.
Считается пригодной для осеменения животных сперма быка и барана с резистентностью спермиев не менее 10-40 тысяч.
2. Оценку качества свежеполученной спермы по скорости обесцвечивания метиленовой синьки проводят при температуре 18-220С, т. к. понижение температуры замедляет интенсивность энергетических процессов и дыхания спермиев. При снижении температуры на 100С интенсивность дыхания уменьшается примерно вдвое, а при 00С почти прекращается.
Приготовление 0,01%-ного раствора метиленовой синьки. 0,5 г синьки растворяют в 200 мл 1%-ного раствора хлористого натрия и настаивают три дня. Затем готовят рабочий раствор: к 1 части раствора синьки добавляют 9 частей 1%-ного раствора хлористого натрия.
Порядок работы
На предметное стекло глазной пипеткой нанести по одной капле краски и спермы и быстро смешать их стеклянной палочкой. Смесь набрать в стеклянную трубочку, чтобы столбик ее был длиной около 2 см. Трубку положить на лист белой бумаги и наблюдать за обесцвечиванием синьки. Обычно она обесцвечивается в середине столбика. На концах столбика могут оставаться голубые кольца, т. к. с концов смесь постоянно обогащается кислородом воздуха.
Для оценки качества спермы жеребца и хряка этот метод не используется, поскольку обесцвечивание смеси метиленовой синьки со спермой затягивается до 60 минут.
Оболочка спермиев, у которых энергично протекают обменные процессы, не пропускает в протоплазму лабораторные краски, поэтому живые спермии не окрашиваются. Мертвые и ослабленные с колебательным движением спермии легко пропускают краску внутрь и, следовательно, окрашиваются этой краской.
Наличие в сперме мертвых и патологически измененных спермиев снижает качество спермы. Наличие в сперме патологических (уродливых) форм спермиев выше допустимого называется тератоспермией. Выделяют две группы патологических форм спермиев: 1) с изменением величины и формы головки – гигантские, карликовые, двухголовые, с круглой, грушевидной головкой и др.; 2) с изменениями формы хвоста. Можно также обнаружить спермии с утолщением в области шейки, тела и хвоста в виде протоплазматической капли (незрелые сперматозоиды).
Способы подготовки обезжиренных стекол. 1. Чистые стекла выдерживают в смеси спирта и эфира (соотношение 1:1) в течение суток. Затем извлекают и протирают насухо.
2. После тщательного мытья в растворе детергента предметные стекла промывают в дистиллированной воде, протирают, заворачивают в бумагу и выдерживают в сушильном шкафу не менее 30 минут.
3. Полевой способ. На холодную поверхность электроплиты помещают в один слой чистые стекла. После того как стекла раскалятся, плиту выключают. Дают стеклам остыть.
Рецепт краски. В 100 мл дистиллированной воды растворяют 1,7 г эозина и 3 г цитрата натрия.
Порядок работы
На обезжиренное предметное стекло нанести 1 каплю семени и 1-2 капли краски эозина. Капли смешать и ребром шлифованного стекла сделать тонкий ровный мазок. Он должен быстро высохнуть на воздухе. Активные спермии, сохранившие избирательную способность мембран, отталкивают краску и не окрашиваются, неактивные окрашиваются в красный или розовый цвет.
Просмотреть мазок под микроскопом. В каждом поле зрения следует подсчитать количество нормальных и патологических, или живых и мертвых, спермиев. Рекомендуется подсчитать не менее 500 спермиев.
Вычисляют процент неактивных спермиев, он не должен превышать у барана – 14, быка – 18, у жеребца и хряка – 20.
Задание для самостоятельной работы
Задание 1. Оценить качество спермы быка по времени обесцвечивания. Сделать вывод о пригодности ее для искусственного осеменения.
Задание 2. Визуально оценить сперму быка по густоте и активности. По результатам заданий 1 и 2 сделать вывод о целесообразности ее использования.
Задание 3. Просмотреть препарат под микроскопом при увеличении 300-600 раз и зарисовать в тетрадь одно поле зрения . Отметить эозинотрицательные (активные, живые) и эозинположительные (неактивные, мертвые) спермии.
Практическое занятие № 5. Тема: Влияние на спермии физических и химических факторов. Исследование глубокозамороженного семени.
Цель занятие: Изучить факторы влияющие на жизнеспособность спермиев, освоить навыки исследования глубокозамороженной спермы.
Приборы и материалы. Микроскоп, обогревательный столик Морозова, предметные и покровные стекла, пипетки, стеклянные палочки, чашка со льдом или снегом, горячая вода; 1%- и 3%-ные растворы хлористого натрия, дистиллированная вода, 1-2%-ный раствор бикарбоната натрия, 2,8-3,0%-ный раствор цитрата натрия, 1-2%-ный раствор уксусной кислоты, 10%-ные растворы серной кислоты и едкого натра, раствор марганцовокислого калия (1:5000), раствор фурацилина (1:5000), 70%-ный спирт, 5%-ный спиртовой раствор йода; салфетки, сосуд Дьюара с замороженной спермой, , водяная баня с термометром, корнцанг, пинцет, предметные и покровные стекла, стеклянные палочки, ампулы с 2,8-3,0%-ным цитратом натрия, 70%-ный спирт, салфетки.
План:
1.Факторы влияющие на жизнеспособность спермиев.
2. Техника безопасности при работе с жидким азотом.
3. Методы оттаивания спермы с. х. животных.
4. Учет и отчетность в искусственном осеменении
Теоретическая часть
Осмотическое давление. Спермин могут жить в среде с определенным осмотическим давлением, которое должно полностью уравновешивать осмотическое давление самих спермиев. Осмотическое давление создается растворенными химическими веществами.
У сельскохозяйственных животных осмотическое давление спермы находится в пределах от 7,6 до 9,0 атм. Спермин, помещенные в среду с меньшим осмотическим давлением (гипотонические растворы), . набухают, в среду с повышенным осмотическим давлением (гипертонические растворы) — сморщиваются; том и другом случае быстро наступает их гибель. Даже незначительное несоответствие осмотического давления заметно ухудшает выживаемость спермиев. Исходя из этого, среда для разбавления спермы, а также рабочие растворы должны быть изотоничными сперме. К ним следует отнести 1%-ный раствор натрия хлорида, 1%-ный раствор натрия гидрокарбоната, 3%-ный раствор натрия цитрата, 6,4%-ный раствор глюкозы.
Действие солей. Ионы электролитов, находящиеся в плазме и в самих спермиях, могут оказывать на спермин разнообразное действие: уплотнять или разрыхлять оболочку спермия; нейтрализовать электрический заряд; изменять проницаемость мембран, тормозить или, наоборот, активизировать метаболические процессы. Электролиты состоят из катионов и анионов. Одно - и двухвалентные катионы существенно не изменяют выживаемость спермиев. Анионы оказывают более сильное влияние, чем катионы, причем действие анионов зависит от валентности. Анионы хлоридов разрыхляют оболочку спер-миев и разрушают липопротеидный покров. Анионы фосфатов, сульфатов, цитратов, наоборот, уплотняют оболочку спермиев и стабилизируют электрический потенциал. В связи с этим соли фосфорной, серной, лимонной кислот используются в составе сред для разбавления спермы.
Действие химических веществ и медикаментов. Большинство химических соединений для спермиев токсичны. Из неорганических веществ особенно ядовиты соли и окислы тяжелых металлов (ртуть, свинец), поскольку они блокируют ферментные системы. Вредно действуют на спермиев окислы цинка, алюминия, железа, меди, серебра, поэтому в практике искусственного осеменения пользуются стеклянными, пластмассовыми, хромированными, никелированными инструментами.
Пары летучих органических веществ (лизол, креолин, скипидар, формалин, нашатырный спирт, эфир, йодоформ, ксероформ) губительно действуют на расстоянии. Поэтому список веществ, используемых для химической дезинфекции на предприятиях и пунктах искусственного осеменения, весьма ограничен. Следует также учитывать неблагоприятное действие табачного дыма, паров одеколона, духов, чеснока, лука.
Чрезвычайно сильно действуют на спермиев детергенты (моющие средства), неорганические кислоты (серная, соляная, азотная), ряд органических кислот (уксусная, молочная, масляная), окислители (йод, хлор, калия перманганат, перекись водорода).
Спирты малотоксичны. Например, этиловый спирт спермин переносят в концентрации 5%. К многоатомным спиртам (глицерин, этиленгликоль) они довольно устойчивы.
Из антимикробных средств малотоксичны нитрофураны (фурацилин, фуразолидон). Некоторые сульфаниламиды (стрептоцид) и большинство антибиотиков в низких концентрациях безвредны и их используют в составе разбавителей для спермы.
Практическая часть
1.С момента получения спермы спермии, находясь вне организма производителя, подвергаются воздействию ряда факторов окружающей среды. Семенная плазма, представляющая в основном совокупность секретов придаточных половых желез, действием растворенных в ней веществ активизирует спермии и сокращает их жизнь. Кроме того, при разбавлении и хранении спермы на спермии влияют такие факторы, как свет, температура, осмотическое давление, различные химические вещества, которые при определенных условиях могут способствовать удлинению их жизни вне организма самца или, наоборот, оказывать на них губительное действие.
|
Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 4 5 |
