Методические указания к практическим работам по дисциплине «Биотехника репродукции животных» (стр. 5 )

1. Влияние осмотического давления. Осмос – диффузия растворенных веществ через проницаемую оболочку, разделяющую раствор и чистый растворитель или два раствора разной концентрации. Давление растворенного вещества называется осмотическим и исчисляется в атмосферах. Сперма животных имеет постоянное осмотическое давление (7 атмосфер), причем осмотическое давление сыворотки спермы и протоплазмы спермиев примерно одинаковое. В том случае, когда осмотическое давление раствора равно осмотическому давлению спермиев, он является изотоническим. Гипотонический и гипертонический растворы губительно влияют на спермии.

Порядок работы

Приготовить три раздавленных капли спермы, определить активность спермиев. Под покровное стекло внести каплю дистиллированной воды, 1%-ного или 3%-ного раствора хлористого натрия. Сперму просмотреть под микроскопом при большом увеличении.

При внесении в сперму дистиллированной воды происходит быстрая гибель спермиев вследствие их гидратации (набухания головки), у части спермиев закручиваются хвосты. Под влиянием 3%-ного раствора хлористого натрия спермии погибают через 1-2 минуты вследствие обезвоживания. Головки спермиев сморщиваются, уменьшаются в размерах. 1%-ный раствор хлористого натрия изотоничен по отношению к спермиям.

2. Влияние температуры. Температура является важнейшим условием, определяющим жизнеспособность спермиев вне организма. При повышении температуры все жизненные процессы в них усиливаются, при понижении – замедляются.

Порядок работы

Приготовить две раздавленных капли спермы, определить активность спермиев.

Сперму просматривать под микроскопом при малом увеличении. Одно предметное стекло нагреть до 50-550С. Вначале отмечается усиление активности спермиев, затем наступает их гибель. Предметное стекло с другой раздавленной каплей поместить на 1-2 минуты на лед и, протерев нижнюю часть стекла салфеткой, просмотреть под микроскопом. Затем подогреть предметное стекло до 400С на обогревательном столике. В первом случае все спермии будут неподвижны, при повышении температуры часть спермиев восстанавливает подвижность, остальные – мертвые.

3. Влияние химических веществ. Сперма чрезвычайно чувствительна к различным химическим веществам. Даже следы мыла на руках или посуде губительно действуют на спермии. Поэтому следует тщательно прополаскивать дистиллированной водой посуду и инструменты после мойки и дезинфекции. В помещении пункта искусственного осеменения запрещается хранить медикаменты и дезинфицирующие вещества, а также курить.

Порядок работы

После оценки активности выявляют влияние различных химических веществ на спермии. Для этого каждый раз на чистое предметное стекло наносят новую каплю спермы и действуют на нее тем или иным испытуемым раствором. Капли перемешивают, накрывают покровным стеклом и просматривают под микроскопом при малом увеличении. Устанавливают время, через которое прекращается движение спермиев. Для изучения влияния йода вокруг капли спермы нанести настойку в виде кольца и, не покрывая покровным стеклом, просматривать под микроскопом.

При внесении в сперму 70%-ного спирта, 10%-ных растворов кислоты и щелочи, марганцовокислого калия, фурацилина наступает гибель сперматозоидов через 1-2 минуты. Раствор кислоты малой концентрации вызывает замедление движения спермиев (кислотный анабиоз). При слабо щелочной реакции среды активность спермиев повышается.

Из настойки йода улетучивается свободный йод, который вызывает быструю гибель спермиев. Проникновение и накопление йода в сперме подтверждается пожелтением капли.

При работе со спермой в лабораториях станций и пунктов искусственного осеменения необходимо соблюдать условия, обеспечивающие длительный срок хранения спермы с сохранением оплодотворяющей способности спермиев.

2. Техника безопасности при работе с жидким азотом. Жидкий азот – прозрачная, бесцветная, легкоиспаряющаяся жидкость. Массовая плотность его 0,804 кг/л при давлении 760 мм ртутного столба. В обычных условиях химически инертен. Производят его путем сжижения газообразного азота. Доставляют жидкий азот до потребителей с заводов-поставщиков транспортными цистернами различной емкости, установленными на соответствующих автомобилях.

Замороженную в жидком азоте сперму производителей закладывают на длительное хранение в сосуды Дьюара емкостью 50 л и стационарные биохранилища на 200-500 л.

Транспортировку замороженной спермы на пункты искусственного осеменения и хранение ее там осуществляют в сосудах Дьюара емкостью 5, 20 и 30 л.

При попадании на открытые участки тела жидкий азот вызывает ожоги, при испарении большой массы жидкого азота из-за снижения концентрации кислорода в воздухе возможны головокружение, обморок или удушье, поэтому при работе с ним необходимо соблюдать правила безопасности.

1. Общие правила при работе с жидким азотом: тщательная защита лица, глаз, рук; одежда, полностью закрывающая кожный покров тела; вентиляция помещения.

2. Особую осторожность следует соблюдать при оттаивании глубокозамороженной спермы в соломинках и облицованных гранулах, т. к. при плохой герметизации проникший внутрь жидкий азот при оттаивании быстро испаряется, увеличивает давление и разрывает оболочку.

3. Для извлечения из сосудов Дьюара замороженной спермы следует использовать предварительно охлажденные инструменты, чтобы предотвратить бурное кипение и разбрызгивание жидкого азота. Не следует заглядывать в сосуд Дьюара с целью определения уровня жидкости в нем, для этого используют специальную линейку.

При длительном хранении в жидком азоте на станциях и племпредприятиях сперму замораживают до температуры –1960С в однодозовых стеклянных или пластмассовых ампулах, облицованных и необлицованных гранулах, соломинках (пайеттах).

Этот способ позволяет хранить сперму многие месяцы и даже годы. Однако для этого требуется строгое соблюдение следующих правил:

1) не допускается преждевременное оттаивание спермы и повторное ее замораживание. Даже кратковременное повышение температуры до –1250С, например, при перекладывании ампул со спермой из стационарного хранилища в транспортный сосуд Дьюара или из одного сосуда в другой, вредно отражается на качестве спермы. Поэтому до использования сперму постоянно хранят в жидком азоте. Нарушение этого правила приводит к гибели спермиев и снижению качества спермы;

2) перед использованием спермы оператор в защитных очках и в перчатках извлекает ампулу (гранулу или соломинку) из сосуда Дьюара и производит оттаивание, предварительно подготовив все необходимые для этой работы инструменты и оборудование.

3.Оттаивание и оценка спермы быка, замороженной в соломинках. Сперму в соломинках оттаивают в водяной бане при температуре 38...40°С в течение 10-11 секунд. Соломинку обтирают марлевой салфеткой и, держа за конец, встряхивают, чтобы воздушный пузырек опустился к пробке. Острыми ножницами отрезают пробку с одного конца соломинки, опускают во флакон или ампулу с 1 см3 2,9% раствора натрия цитрата нейтрализованного, отрезают второй конец соломинки. После перемешивания каплю разбавленной спермы наносят на предметное стекло, накрывают покровным стеклом и оценивают по подвижности.

Оттаивание и оценка спермы быка, замороженной в облицованных гранулах.

Обойму с тубами поднимают стержнем-держателем на уровень жидкого азота, открывают пробки и из каждого контейнера отбирают пинцетом с плоскими браншами по одной грануле, которые переносят на 8-10 секунд в подогретую до 40°С воду.

Поверхность пленочной оболочки гранулы с оттаянной спермой вытирают стерильной салфеткой, вскрывают ножницами и определяют подвижность под микроскопом. При использовании оптически прозрачной пленки гранулы не вскрывают, а оценивают сперму под микроскопом через прозрачную стенку.

Оттаивание спермы быка, замороженной в открытых гранулах.

Одну гранулу (дозу) помещают во флакон или ампулу с 1 см3 2,9% раствора натрия цитрата нейтрализованного, предварительно помещенные в водяную бани при температуре 38...40°С, Флакон или ампулу, не доставая из водяной бани, осторожно покачивают до оттаивания гранулы, после чего вынимают из воды и ставят на стол при температуре 18...20°С. Категорически запрещается оттаивать гранулы при комнатной температуре. Оттаянную сперму оценивают по подвижности. Замороженная сперма быка после ее оттаивания должна соответствовать требованиям действующего ГОСТа на сперму. Биологические исследования замороженной спермы быков проводят дважды: через 24 часа после замораживания и при передаче в стационарное хранилище (банк спермы). Сперму отправляют в хозяйство не ранее, чем через 30 дней карантинного срока.

Оттаивание замороженной спермы козла и барана. По 1 грануле замороженной спермы из каждой серии помещают во флакон с 1 см 2,9% раствора натрия цитрата нейтрализованного в водяной бане при 40...42°С до полного оттаивания гранулы. Подвижность сперматозоидов определяют под микроскопом. Сперму с подвижностью ниже 4 баллов бракуют.

Оттаивание замороженной спермы жеребца. Качество замороженной спермы жеребца оценивают через 24 часа после замораживания. Оттаивают несколько гранул или один пакет (объем спермы в контрольном пакете может быть уменьшен до 5 см3) из каждого эякулята и проверяют подвижность сперматозоидов. Для дальнейшего хранения и искусственного осеменения допускают сперму с оценкой не ниже 2,5 баллов.

Оттаивание и оценка спермы жеребца, замороженной в алюминиевых пакетах.

Пакет со спермой достают из жидкого азота корнцангом или пинцетом, быстро погружают в водяную баню при температуре 40"С и, слегка покачивая его, выдерживают 45-50 секунд. Затем пакет вытирают стерильным полотенцем, один конец протирают спиртовым тампоном и отрезают стерильными ножницами. Оттаянную сперму оценивают по подвижности.

Оттаивание и оценка спермы жеребца, замороженной в виде гранул.

Тубу или стакан со спермой пинцетом вынимают из жидкого азота, раскрывают, гранулы быстро пересыпают в стерильную коническую колбу (500 см), погруженную в водяную баню с температурой 40°С (гранулы спермы должны размещаться на дне колбы в один слой), выдерживают, слегка покачивая, до полного оттаивания. Оттаянную сперму оценивают по подвижности.

Оттаивание спермы в гранулах. Гранулы бывают трех видов: 1) необлицованные гран,1-0,2 мл (с высокой концентрацией спермиев и с разбавлением дозы изотоническими растворами перед осеменением); 2) необлицованные гран,5-1,0 мл (со средней концентрацией спермиев, разбавления дозы не требуется); 3) гранулы, облицованные в полимерную оболочку (объем 0,25-0,33 мл).

Порядок работы

1. Для оттаивания гранул объемом 0,1-0,2 мл одну-две ампулы с раствором цитрата натрия поместить на 1-2 минуты в водяную баню с температурой 38-400С.

2. К горловине сосуда Дьюара быстро подтянуть канистру или марлевый мешочек с гранулами. Стерильным и охлажденным в жидком азоте пинцетом извлечь нужное количество гранул и опустить их в подготовленные ампулы с раствором цитрата натрия.

3. Оттаивать гранулы спермы в течение 8-10 с до полного превращения их в жидкое состояние. После этого ампулы со спермой сразу же вынуть из водяной бани, не допуская дальнейшего нагревания спермы. Одновременно при размораживании быстро опустить канистру, закрыть сосуд крышкой.

4. Ампулы вытереть насухо салфеткой и поставить в штатив, где сперма постепенно приобретает температуру 18-250С.

5. Набрать сперму в инструмент. Сделать мазок, оценить качество спермы. Замороженную сперму быка используют после оттаивания при активности спермиев не ниже 3 баллов. В дозе спермы для осеменения коров и телок должно быть не менее 10-12 млн. спермиев с прямолинейно-поступательным движением (при всех способах хранения).

4.Учет и отчетность должны быть простыми, краткими, но точно отражающими всю производственную деятельность и дающими возможность оперативно контролировать работу пунктов искусственного осеменения сельскохозяйственных животных.

Задание для самостоятельной работы

Задание № 1. Провести исследование влияния осмотического давления на жизнеспособность спермиев. Записать наблюдения, сделать выводы.

Задание № 2. Провести исследование влияния температуры окружающей среды на жизнеспособность спермиев. Записать наблюдения, сделать выводы.

Задание № 4 . Провести исследование влияния различных химических веществ и их концентрации на жизнеспособность спермиев. Записать наблюдения, сделать выводы.

Задание № 3. Разморозить дозу спермы. Оценить ее качество (активность, густота, концентрация). Сделать выводы о пригодности спермы для осеменения.

Задание № 4. Ознакомиться с документами учета и отчетности, применяемыми на пунктах искусственного осеменения для учета работы по воспроизводству стада на сельскохозяйственных предприятиях. Обратить внимание на назначение и срок составления каждого документа, какие показатели учитываются и кто ведет записи.

Задание № 5. Изучить методы контроля воспроизводства стада (расчет продолжительности межотельного периода и сервис-периода, выхода телят, яловости коров).

Список используемой литературы.

Обязательная

1.Ветеринарное акушерство, гинекология и биотехника размножения / , , и др.: Под ред. и . 7-е изд., перераб. и доп. М.: Колос, 1999. 495 с.

2.Ветеринарное акушерство и гинекология / , , ; Под ред. . – 6-е изд., испр. и доп. М.: Агропромиздат, 1986. – 480 с.

3.Практикум по акушерству, гинекологии и искусственному осеменению сельскохозяйственных животных / и др. М.: Агропромиздат, 1988. 335 с.

4.Акушерство, гинекология и биотехника размножения животных: Методические указания для студентов IV курса факультета ветеринарной медицины / Сост. , , ; ФГОУ ВПО “Саратовский ГАУ”. Саратов, 2002. 100 с.

Дополнительная

1.Вракин по анатомии с основами гистологии и эмбриологии сельскохозяйственных животных. – М.: Колос, 2003.

2. практикум по физиологии сельскохозяйственных животных. – Мн.: Ураджай, 2000.

3.Большая медицинская энциклопедия. – Москва: Медицина, 1986.