Работа 2. Получение препарата амилазы из бактерий Bacillus subtilis.
Методика.
Бактерии Bacillus subtilis культивируют с аэрацией при 25–28 °С в течение 24–48 ч в жидкой питательной среде Лурия-Бертани (LB), содержащей 1 % растворимого крахмала. Клетки отделяют центрифугированием при 7 тыс. об/мин 5 мин, надосадочную культуральную жидкость используют как источник бактериальных амилаз.
Определение активности фермента. В пробирке смешивают 1 мл полученной надосадочной жидкости Bacillus subtilis (или фильтрата Aspergillus niger) с 2 мл 1 % раствора крахмала. 20 мкл смеси с помощью автоматической пипетки помещают на предметное стекло, добавляют 20 мкл раствора Люголя. Наблюдают интенсивно синее окрашивание. Пробирку с реакционной смесью помещают на водяную баню при 40 °С и через каждые 2 мин повторяют отбор проб. По мере расщепления крахмала пробы с иодом будут окрашиваться в различные цвета вследствие образования декстринов разной степени сложности:
амилаза, присутствующая в крахмале, дает синее окрашивание с иодом (м. м. до 500 000);
амилодекстрины – сине-фиолетовое (м. м. около 10 000);
эритродекстрины – красно-бурое (м. м. 4000–6000);
декстрины, имеющие низкий молекулярный вес, не окрашиваются иодом.
ПРОТОКОЛ ИССЛЕДОВАНИЯ
Скорость гидролиза крахмала бактериальной (грибной) амилазой
Время гидролиза (мин) | Окрашивание пробы | Продукты гидролиза |
0 | синее | нет |
2 | ||
4 | ||
6 | ||
8 | ||
10 | ||
12 |
МОДУЛЬ 1. Морфология, систематика, физиология микроорганизмов.
Практическое занятие 3. Культивирование, питание и рост микроорганизмов.
Цели и задачи. Изучить методы культивирования микроорганизмов. Культуральные признаки бактерий. Рост микроорганизмов на плотных и жидких питательных средах.
Вопросы для самоподготовки:
1. Механизм поступления питательных веществ в клетку бактерий, мембранный транспорт, диффузия.
2. Типы питания микроорганизмов. Фототрофия и хемотрофия, автотрофия и гетеротрофия; литотрофия и органотрофия. Сапрофиты и паразиты. Прототрофы и ауксотрофы.
3. Основные типы сред, используемые для культивирования аэробных и анаэробных микроорганизмов (по составу и физическому состоянию).
4. Отношение бактерий к источникам углерода. Богатые и синтетические среды
5. Культуральные признаки бактерий. Рост микроорганизмов на плотных и жидких питательных средах.
6. Накопительные, чистые и смешанные культуры микроорганизмов. Методы их получения и значение.
7. Проточное и непрерывное культивирование.
8. Получение чистых культур микроорганизмов.
Основные понятия темы
Культивирование микроорганизмов осуществляют при создании ряда условий с учетом типов питания, дыхания, отношения к температуре и скорости размножения.
Для культивирования сапрофитов и факультативных паразитов используют исскусственные питательные среды, которые по своему назначения бывают простые, элективные и дифференциально-диагностические, а по консистенции – жидкие, полужидкие и плотные.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РАБОТЫ
Работа 1. Типы питательных сред, методы культивирования микроорганизмов.
Составить и заполнить таблицу «Среды для культивирования разных групп микроорганизмов».
Группы микроорганизмов | Тип питания | Тип дыхания | Пример питательной среды |
1. Стафилококки | |||
2. Клостридии | |||
3. Вирусы | |||
4. Микоплазмы |
Методы культивирования анаэробов
ПРОТОКОЛ ИССЛЕДОВАНИЯ:
Методы, среды | Условия |
1. Физический. 2. Химический 3. Биологический |
Работа 2. Методы выделения чистых культур.
1. Выделение чистой культуры из отдельной колонии.
Основным методом выделения чистых культур микроорганизмов является метод, предложенный Р. Кохом. Принцип его заключается в получении чистой культуры из отдельной колонии. Однако этот метод неприменим для выделения микроорганизмов, которые не растут или плохо растут на плотных средах. К числу таких микроорганизмов относятся некоторые бактерии, многие водоросли и простейшие.
При выделении чистой культуры аэробных микроорганизмов накопительную культуру высевают на поверхность плотной среды. Порядок работы следующий. Расплавленную на кипящей водяной бане стерильную и охлажденную до 500С питательную среду, содержащую агар или желатину, разливают в стерильные чашки Петри. После того как среда застынет, на ее поверхность из пипетки наносят каплю накопительной культуры или ее разведения в стерильной воде и стерильным стеклянным шпателем Дригальского распределяют каплю по поверхности плотной среды в чашке Петри. Далее этим же шпателем протирают поверхность среды последовательно во второй, третьей и четвертой чашках. Обычно, в первых двух чашках после инкубации наблюдается сплошной рост микроорганизмов, тогда как, в последующих — рост изолированных колоний. Рассевать накопительную культуру можно бактериологической петлей методом истощающего штриха. В этом случае накопительную культуру или ее разведение отбирают петлей и на поверхности плотной среды проводят штрихи в порядке, указанном на рис. Перед каждым новым штрихом петлю стерилизуют в пламени горелки.
После посева чашки Петри помещают в термостат крышками вниз, чтобы конденсационная вода, образовавшаяся на крышке чашки при застывании агара, не помешала получить изолированные колонии. Чашки выдерживают в термостате в течение 1 —7 сут в зависимости от скорости роста микроорганизмов. Выросшие изолированные колонии отсевают петлей на поверхность скошенной плотной среды в пробирке или в жидкую среду.
Метод глубинного посева. Изолированные колонии микроаэрофильных микроорганизмов и факультативных анаэробов чаще получают методом глубинного посева. Для этого плотную питательную среду предварительно разливают в пробирки по 15 —20 мл и стерилизуют. Непосредственно перед посевом пробирки помещают в кипящую водяную баню, чтобы среда расплавилась. Высев проводят из разведений накопительной культуры в стерильной водопроводной воде. Разведения готовят с таким расчетом, чтобы при высеве 0,5— 1,0 мл разведения получить изолированные колонии. Степень разведения определяется плотностью накопительной культуры. Высевы делают, как правило, из трех-четырех последних разведений. Для этого в пробирку с расплавленной и остуженной до 48 — 50°С средой вносят 0,5—1,0 мл одного из разведений накопительной культуры. Посевной материал тщательно перемешивают, вращая пробирку между ладонями. Затем около пламени горелки вынимают из пробирки пробку, обжигая края пробирки в пламени горелки, и быстро выливают содержимое пробирки в стерильную чашку Петри. После того как агаризованная среда застынет, чашки Петри помещают в термостат. Колонии, выросшие в толще среды, вырезают стерильным скальпелем, извлекают стерильными капиллярными трубками или просто петлей и переносят в жидкую среду, благоприятную для развития выделяемых микроорганизмов.
Особые трудности возникают при выделении чистых культур облигатных анаэробов. Если контакт с молекулярным кислородом не вызывает сразу же гибели клеток, то посев проводят на поверхность среды в чашки Петри, но после посева чашки тотчас помещают в анаэростат. Однако чаще пользуются методом разведения. Сущность его заключается в том, что разведения накопительной культуры проводят в расплавленной и охлажденной до 45 — 50 "С агаризованной питательной среде. Делают 6—10 последовательных разведений. Затем среду в пробирках быстро охлаждают и заливают поверхность слоем стерильной смеси парафина и вазелинового масла (в соотношении 3:1), что препятствует проникновению воздуха в толщу агаризованной среды.
Иногда агаризованную питательную среду после посева и тщательного перемешивания переносят в стерильные трубки Бурри. Можно использовать капиллярные пипетки Пастера, в которые набирают соответствующее разведение накопительной культуры в расплавленной агаризованной питательной среде. Конец капилляра запаивают. При удачно выбранном разведении накопительной культуры в одной из пробирок (пипеток Пастера, трубок Бурри) вырастают изолированные колонии. Чтобы извлечь образовавшиеся колонии, поступают следующим образом. Удаляют стерильной иглой слой парафина, а столбик агаризованной среды осторожно выдувают из пробирки в стерильную чашку Петри, пропуская газ, не содержащий кислород, через капилляр или иглу, помещенные между стенкой пробирки и агаризованной средой. Агаризованную среду из трубки Бурри выдувают, пропуская газ через ватную пробку.
В некоторых случаях плотную среду из пробирки извлекают иначе. Пробирку слегка нагревают, все время быстро вращая ее над пламенем горелки. При этом агар, непосредственно прилегающий к стенке, плавится и содержимое пробирки в виде агарового столбика легко выскальзывает в стерильную чашку Петри. Столбик агара разрезают стерильным ланцетом и извлекают колонии, захватывая их стерильными капиллярными трубками или петлей. Можно также вырезать их стерильным ланцетом. Извлеченные колонии переносят в жидкую среду, благоприятную для развития выделяемых микроорганизмов. Если изолированные колонии получены в капилляре, то после тщательной дезинфекции поверхности его разламывают стерильным пинцетом и участки капилляра, содержащие изолированные колонии, переносят в стерильную среду.
|
Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 4 5 6 |
Основные порталы (построено редакторами)