Способ включения квантовых точек в пористые частицы карбоната кальция методом совместного соосаждения

Изобретение относится к области неорганической химии, в том числе к области применения флуоресцентных квантовых точек. Полученная конструкция предназначается для использования в качестве флуоресцентных реагентов (флуоресентных меток, носителей, биомаркеров) в биологических и медицинских исследованиях.

Сущность изобретения заключается в иммобилизации водорастворимых квантовых точек, модифицированных меркаптоэтанолом и меркаптоуксусной кислотой в объеме микрочастиц карбоната кальция методом совместного соосаждения в результате реакции СaCl2 + 2NaHCO3 → CaCO3↓+2NaCl+2H+, в том числе с последующим покрытием полученных частиц слоем (слоями) полимера (противоположно заряженной пары полимеров) для стабилизации полученных частиц и ковалентного присоединения к ним других молекул. Допускается включение в частицы карбоната кальция квантовых точек с пришитыми к ним молекулами полимеров с целью их заякоривания в частице и снижения ее плотности.

Описание изобретения

Квантовые точки – неорганические полупроводниковые нанокристаллы диаметром 2 – 8 нм, обладающие уникальными оптическими свойствами. являются альтернативой органическим флуоресцентным меткам применяемым в биотехнологии и медицине благодаря высокой яркости, возможности регистрировать флуоресценцию по всему оптическому диапазону и доступности. Квантовые точки представлены атомами II и VI групп (CdSe, CdTe) или III и V групп (InP, InAs) периодической системы. [S. K. Vashist, R. Tewari, R. P. Bajpai, L. M. Bharadwaj and R. Raiteri. Review of Quantum Dot Technologies for Cancer Detection and Treatment, Journal of nanotechnology Online DOI : 10.2240/azojono0113, K. T. Lane,  L. S. Beese Thematic review series: Lipid Posttranslational Modifications. Structural biology of protein farnesyltransferase and geranylgeranyltransferase type I, Journal of Lipid Research Volume 47, 2006, 681-699].

НЕ нашли? Не то? Что вы ищете?

Изобретение относится к способам включения квантовых точек в искусственно сформированные пористые частицы (ватерит) на основе карбоната кальция размером 3-5 мкм при совместном осаждении в реакции гидрокарбоната натрия и хлорида кальция СaCl2 + 2NaHCO3 → CaCO3↓+2NaCl+2H+. Данная биосовместимая флуоресцентная конструкция предлагается для использования в качестве флуоресцентных реагентов (флуоресентных меток, носителей, биомаркеров) в различных областях биологических и медицинских исследований.

Известен способ получения пористых частиц карбоната кальция и покрытия их слоями противоположно заряженных полиэлектролитов [Petrov A. I., Volodkin D. V., Sukhorukov G. B. Protein-calcium carbonate coprecipitation: a tool for protein encapsulation, Biotechnol Prog., 2005; 21(3):918-925] для иммобилизации белков. Равные объемы растворов 0,33 М CaCl2 и Na2CO3 быстро смешивают и перемешивают на магнитной мешалке в течение 30 с. Затем образцы оставляют при комнатной температуре на 10-15 мин для формирования сферических частиц карбоната кальция, которые затем промывают последовательно водой и спиртом (ацетоном) и высушивают на воздухе. Полученные частицы поочередно покрывают 5 слоями полиситролсульфоната натрия и полиаллиламингидрохлорида, предварительно растворенные в 0,5 М NaCl. Нанесение каждого слоя осуществляли посредством инкубирования частиц в растворе полиэлектролита в течение 15 мин. Отмывка несвязавшихся полиэлектролитов осуществляется в 0,01 М NaCl 3 раза. Данные частицы не предназначаются для включения квантовых точек.

Известен способ получения пористых частиц карбоната кальция, содержащих белки (проназа) и ДНК. Смешивают 15 мл воды, 0,615 мл 1 М CaCl2, 0,615 мл 1М Na2CO3, 500 мкл раствора проназы (1, 3 или 5 мг/мл) и 500 мкл двухспиральной ДНК, затем в течение 20 с перемешивают на магнитной мешалке при комнатной температуре. Затем осадок выделяют центрифугированием и 3 раза промывают водой. Затем путем адсорбции из водных растворов было нанесено по 7 слоев p-Asp и p-Arg (2 мг/мл, 0,15 М NaCl). Однако данный способ тоже не предполагает включения квантовых точек [Tatiana Borodina, Elena Markvicheva, Stanislav Kunizhev, Helmuth Mo¨hwald, Gleb khorukov, Oliver Kreft Controlled Release of DNA from Self-Degrading Microcapsules // Macromol. Rapid Commun. 2007, 28, 1894–1899].

Прототипом данного метода является способ, предложенный Won и др. Квантовые точки CdSe/ZnS предварительно солюбилизируют в воде за счет покрытия кремниевой оболочки путем формирования обратной наноэмульсии. Для этого 1 мл квантовых точек CdSe/ZnS приливают к смеси 7 мл гексана, 0,6 мл Igepal CO-520 и 0,1 мл гидрохлорида аммония. Приливаемый к раствору тетраэтилортосликат выполняет роль источника формирования кремниевой капсулы. Смесь перемешивают в течение 20 ч. Раствор осаждают метанолом, центрифугируют и диспергируют полученные наночастицы в деионизованной воде. Для получения сферических частиц карбоната кальция готовят растворы 0,33 M Na2CO3 и 0,33 M CaCl2*H2O в 10 мл деионизованной воды. Раствор Na2CO3 приливают к раствору CaCl2*H2O и перемешивают 10 мин на магнитной мешалке. Полученные частицы осаждают центрифугированием и высушивают на воздухе. Затем осуществляют отмывку несвязавшихся модифицированных квантовых точек [Y.-H. Won, H. S.Jang, D.-W. Chung, L. Stanciu Multifunctional calcium carbonate microparticles: Synthesis and biological applications, Brick and NCN Publications, 2010, paper 622]. Недостатком данного метода является неполное включение квантовых точек в состав частиц и преимущественное их распределение по поверхности сферической частицы с проникновением в поры. Кроме того, метод требует длительного периода времени (20 ч), необходимого для модификации квантовых точек.

Задача изобретения заключается в обеспечении полного (100%) включения квантовых точек в пористые частицы карбоната кальция методом совместного соосаждения и сокращении периода времени, необходимого для получения таких флуоресцентных конструкций.

Техническим результатом изобретения является получение флуоресцентных конструкций, обеспечивающих 100% включение квантовых точек в частицы карбоната кальция с их достаточно равномерным распределением по объему частицы без последующего их вымывания при промывке. Степень включения квантовых точек контролируется измерением интенсивности флуоресценции. В результате получают равномерно окрашенные частицы карбоната кальция с цветом в зависимости от выбранного типа (длины волны испускаемой флуоресценции) квантовых точек. Размеры частиц составляют 3-5 мкм (контролируется с помощью оптического микроскопа и методом динамического светорассеяния), хотя отмечается более мелкая фракция порядка 1 мкм. При ряде концентраций в зависимости от характеристик квантовых точек интенсивность флуоресценции возрастает по сравнению с контролем, в то время как при использовании Ca(NO3)2, наоборот, снижается почти в 2 раза. При использовании Ca(NO3)2 квантовые точки при высоких концентрациях исходного раствора 3-5 мг/мл) включаются не полностью и наблюдается выход квантовых точек в раствор при промывке (регистрируется флуоресценция супернатантов после промывок, что свидетельствует о присутствии квантовых точек).

Способ осуществляют следующим образом:

Квантовые точки солюбилизируют согласно модифицированному протоколу, основанному на указанных работах [C. W. Chan, S. Nie, Quantum dot bioconjugates for ultrasensitive nonisotopic detection. Science.-281.- 1998.- P. 2016–2018; J. Aldana, Y. A. Wang, X. Peng, Photochemical instability of CdSe nanocrystalls coated by hydrophilic thiols //J. Am. Chem. Soc. –2001.- V. 123.- P. 8844–8850; S. F. Wuister, I. Swart, F. van Driel, S. G. Hickey, C. de Mello Donega, Highly luminescent water-soluble CdTe quantum dots // Nano Lett.- 2003.- V.3.- P. 503–507]. Приблизительно 3 мг полупроводниковых нанокристаллов (квантовых точек) очищают от избытка ТОФО (триоктилфосфиноксид) трехкратным растворением в хлороформе (500 мкл) и переосаждением метанолом (500 мкл). Очищенные квантовые точки диспергируют в 1 мл хлороформа и к полученной смеси добавляют 400 мкл 1М меркаптоуксусной кислоты и меркаптоэтанола (в соотношении 1:1 об.). Также для солюбилизации квантовых точек используют цистеин. Смесь интенсивно перемешивают, в результате чего НК из хлороформа переходят в водную фазу. Далее смесь центрифугируют, хлороформ удаляют. Полученные солюбилизированные квантовые точки очищают от избытка меркаптоуксусной кислоты и меркаптоэтанола трехкратным растворением в 1 мл метанола, центрифугированием и удалением раствора, после этого квантовые точки сушат при комнатной температуре, диспергируют в очищенной воде и фильтруют через мембранный фильтр с размером пор 0,022 мкм. К раствору 0,3 М NaНCO3 приливают водный раствор модифицированных квантовых точек (0,05-4 мг/мл), интенсивно перемешивают в течение 60 сек., к смеси добавляют 0,2 М CaCl2 и интенсивно перемешивают в течение 90 сек. После этого инкубируют в течение 5 мин для формирования сферических пористых частиц карбоната кальция. Затем полученную взвесь частиц промывают очищенной водой 1-3 раза, 1 раз 96% этанолом и высушивают при комнатной температуре. Агрегация частиц устраняется с помощью обработки дисперсии карбонатных частиц с включенными квантовыми точками ультразвуком после каждой операции промывки. Эффективность включения квантовых точек в частицы контролируется с помощью флуориметра (измеряется интенсивность флуоресценции супернатантов каждой промывки).

При невозможности использования 0,2 М CaCl2 осуществляется его замещение эквимолярным количеством Ca(NO3)2 в результате реакции Сa(NO3)2 + 2NaHCO3 → CaCO3↓+2NaCl+2H+, однако, как отмечено выше, это приводит к частичному вымыванию квантовых точек из карбонатных частиц при промывке.

С целью стабилизации флуоресцентных пористых частиц (для предотвращение слипания) и возможности последующего ковалентного присоединения к ним различных молекул (дополнительные флуорофоры, антитела, антигены, биотин и т. д.) их покрывают оболочкой из различных водорастворимых полимеров (в 0,9% NaCl), обладающих свойствами полиэлектролитов, в качестве положительно заряженных полиэлеткролитов используют,, хитозан, каррагинан, полилизин и т. д., в качестве отрицательно заряженных – полиакриловая кислота, альгинат натрия, полистиролсульфонат натрия, декстран-сульфат натрия и т. д. в диапазоне концентрациий 0,1 – 5 мг/мл), либо полимеров, растворяющихся в органических растворителях (полиэтиленимин, 0,1 - 5 мг/мл). Для предотвращения выхода квантовых точек из частицы и уменьшения ее удельной массы к квантовым точкам ковалентно пришивают молекулы полимеров, например, альгинат, имеющий сродство к пористым микросферам карбоната кальция.

Было установлено, что покрытие частиц водорастворимыми полимерами приводит к выходу части квантовых точек в раствор полиэлектролита, поэтому предлагается формировать ковалентные сшивки между квантовыми точками и молекулами полимеров, в т. ч. альгината натрия, для предотвращения выхода квантовых точек из пор карбонатных частиц.

В связи с высокой дисперсностью размеров получаемых флуоресцентных конструкций предполагается их фракционирование методами фильтрования или дифференциального центрифугирования с целью получения однородных по размерам фракций частиц.

Изобретение иллюстрируют следующие примеры:

Пример 1

К 1 мл 0,3 М раствора NaНCO3 приливают 0,5 мл дисперсии квантовых точек модифицированных меркаптоуксусной кислотой и меркаптоэтанолом (или цистеином) в воде очищенной (0,05-4 мг/мл), , интенсивно перемешивают в течение 60 сек, затем к полученной смеси добавляют 1,5 мл 0,2М раствора хлорида кальция (CaCl2). Полученную взвесь частиц промывают очищенной водой 1-3 раза, 1 раз 96% этанолом и высушивают при комнатной температуре. Агрегацию частиц устраняют с помощью обработки дисперсии карбонатных частиц с включенными квантовыми точками ультразвуком после каждой операции промывки. Эффективность включения квантовых точек в частицы контролируется с помощью флуориметра (измеряется интенсивность флуоресценции супернатантов каждой промывки).

Пример 2

Частицы карбоната кальция, содержащие квантовые точки, получают согласно Примеру 1 и инкубируют при перемешивании последовательно в течение 1- 10 мин в растворе положительно заряженного полиэлектролита хитозана с концентрацией в диапазоне 0,1 – 5 мг/мл в водном растворе уксусной кислоты с последующей промывкой водой для удаления несвязавшихся молекул хитозана, затем в растворе отрицательно заряженного полиэлектролита полистиролсульфоната натрия в 0,9% NaCl с концентрацией в диапазоне 0,1 – 5 мг/мл в течение 1- 10 мин с последующей промывкой водой для удаления несвязавшихся молекул. Суммарное количество слоев – от 2 до 8. После каждой операции (нанесение слоя полимеров, промывка) осуществляют обработку дисперсии карбонатных частиц с включенными квантовыми точками ультразвуком в течение 1-5 сек.

Пример 3

Поступают по П. 2, используя вместо раствора хитозана раствор полилизина в 0,9% NaCl с концентрацией 0,3 мг/мл, и раствор полистиролсульфоната натрия в концентрации 1 мг/мл в течение 1- 10 мин с последующей промывкой водой для удаления несвязавшихся молекул. Суммарное количество слоев – от 2 до 8. После каждой операции (нанесение слоя полимеров, промывка) осуществляют обработку дисперсии карбонатных частиц с включенными квантовыми точками ультразвуком в течение 1-5 сек.

Пример 4

Поступают по П.2, используя вместо раствора хитозана раствор каррагинана с концентрацией 2 мг/мл ( содержащий 0.9% NaCl), а вместо полистиролсульфоната натрия - раствор полиакриловой кислоты с концентрацией 2 мг/мл.

Пример 5

Поступают по П.2, используя вместо раствора хитозана раствор полилизина в 0,9% NaCl с концентрацией 0,5 мг/мл, а вместо полистиролсульфоната натрия - раствор полиакриловой кислоты с концентрацией 1 мг/мл.

Пример 6

Частицы карбоната кальция, содержащие квантовые точки, получают согласно Примеру 1 и инкубируют 1 раз при перемешивании в растворе полиэтиленимина (1 мг/мл, этанол) с последующей отмывкой водой.

Формула изобретения

Способ включения квантовых точек в пористые частицы карбоната кальция методом совместного соосаждения, отличающийся тем, что основан на процессе включения квантовых точек непосредственно в процессе формирования пористых частиц карбоната кальция в результате реакции СaCl2 + 2NaHCO3 → CaCO3↓+2NaCl+2H+, при этом квантовые точки солюбилизируют согласно модифицированному протоколу (К раствору 0,3 М NaНCO3 приливают водный раствор модифицированных квантовых точек (0,05-4 мг/мл), интенсивно перемешивают в течение 60 сек., к смеси добавляют 0,2 М CaCl2 и интенсивно перемешивают в течение 90 сек. После этого инкубируют в течение 5 мин для формирования сферических пористых частиц карбоната кальция. Затем полученную взвесь частиц промывают очищенной водой 1-3 раза, 1 раз 96% этанолом и высушивают при комнатной температуре. Агрегация частиц устраняется с помощью обработки дисперсии карбонатных частиц с включенными квантовыми точками ультразвуком после каждой операции промывки. Эффективность включения квантовых точек в частицы контролируется с помощью флуориметра (измеряется интенсивность флуоресценции супернатантов каждой промывки)). Способ по п. 1, отличающийся тем, что полученные частицы покрывают слоями (суммарное количество слоев от 2 до 8) противоположно заряженных водорастворимых полиэлектролитов Способ по п. 1, отличающийся тем, что процесс нанесения слоев осуществляют в органическом растворителе (этаноле), качестве покрытия используют полимеры, растворяющиеся в органических растворителях (например, полиэтиленимин) Способ по п. п. 1, 2 и 3, отличающийся тем, что к включаемым квантовым точкам ковалентно пришивают молекулы полимеров (например, альгинат натрия). Способ по п. 1, отличающийся тем, что вместо хлорида кальция (CaCl2) используют эквимолярное количество нитрата кальция Ca(NO3)2.

Реферат

Описывается способ включения квантовых точек методом совместного соосаждения в пористые частицы карбоната кальция (CaCO3), в том числе частиц, покрытых слоями водорастворимых полиэлектролитов либо полимеров, растворимых в органических растворителях. Способ позволяет получить таким образом флуоресцентные конструкции для биологических и медицинских исследований.