Биохимия (стр. 3 )

Реакция Фоля (на аминокислоты, содержащие слабосвязанную серу).

Принцип метода. Основан на щелочном гидролизе сульфгидрильных групп SH белка с последующим отщеплении серы в виде сульфида свинца (PbS) черно-бурого цвета (см. уравнение).

ВНИМАНИЕ! Соблюдать меры безопасности при работе с реактивом Фоля (содержит NaOH и Na2PbO2).

Ход работы. В три пробирки наливают по 5 капель растворов: в 1-ю – яичного белка, во 2-ю – желатина, в 3-ю – миозина. В каждую пробирку добавляют по 5 капель реактива Фоля. Затем интенсивно кипятят и дают постоять 1–2 мин. При этом в 1-й и в 3-й пробирках образуется черный или бурый осадок сульфида свинца. Желатин осадка не образует, т. к. в нем нет серосодержащих аминокислот.

Выводы по результатам работы.

_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Лабораторная работа № 2. Реакции осаждения белков

Осаждение белков при кипячении.

ВНИМАНИЕ! Соблюдать меры безопасности при работе с нагреванием пробирок.

Ход работы. В 5 пробирок наливают по 5 капель раствора белка. Первую пробирку нагреть до кипения. Жидкость мутнеет, т. к. разрушаются водные оболочки вокруг молекулы белка, и происходит укрупнение его частиц. Мицеллы белка несут заряд и удерживаются во взвешенном состоянии.

Во 2-й пробирке нагреть раствор до кипения и добавить 2 капли 1 %-го раствора уксусной кислоты до слабого подкисления. При отстаивании выпадает осадок белка. Частицы белка теряют заряд и приближаются к изоэлектрическому состоянию.

В 3-ю пробирку добавить 5 капель уксусной кислоты для сильнокислой реакции среды. При кипячении жидкости осадка не образуется, поскольку белковые мицеллы перезаряжаются и несут положительный заряд, что повышает их устойчивость.

В 4-ю пробирку налить 5 капель раствора уксусной кислоты, 2 капли насыщенного раствора хлористого натрия и нагреть. Выпадает белый хлопьевидный осадок, т. е. частицы белка теряют заряд.

В 5-ю пробирку добавить 2 капли раствора гидроксида натрия. При кипячении осадок не образуется, т. к. в щелочной среде отрицательный заряд на частицах белка увеличивается.

Выводы по результатам работы.

_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Осаждение белков концентрированными минеральными кислотами.

ВНИМАНИЕ! Соблюдать меры безопасности при работе с концентрированными азотной и серной кислотами.

Ход работы. В 2 пробирки наливают по 10 капель концентрированных кислот: азотной и серной. Наклонив пробирки под углом 45 градусов, осторожно по стенке пробирки приливают равный объем раствора белка так, чтобы обе жидкости не смешивались. На границе двух жидкостей образуется осадок в виде небольшого белого кольца. При добавлении избытка азотной кислоты осадок не исчезает, а при добавлении серной кислоты осадок растворяется.

Выводы по результатам работы.

_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Осаждение белков органическими растворителями.

Ход работы. В 2 пробирки вносят по 5 капель раствора белка и прибавляют по 15–20 капель этилового спирта и ацетона.

Выводы по результатам работы.

_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Осаждение белков органическими кислотами.

ВНИМАНИЕ! Соблюдать меры безопасности при работе с трихлоруксусной кислотой.

Ход работы. В две пробирки наливают по 5 капель раствора белка и добавляют по 2 капли раствора ТХУ (трихлоруксусной кислоты) в одну и 2 капли сульфосалициловой – в другую. Следят за изменением растворов.

Выводы по результатам работы.

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

_

_

_

Лабораторная работа № 3. Разделение альбуминов и глобулинов методом высаливания (УИРС)

Принцип метода. Основан на обратимой реакции осаждения белков из растворов с помощью высоких концентраций нейтральных солей (NaCl, NH4Cl, MgSO4 и др.).

Ход работы. К 1 мл неразведенного яичного белка добавляют 1 мл насыщенного раствора сульфата аммония и перемешивают. Получается полунасыщенный раствор сульфата аммония, в котором выпадает осадок яичного глобулина. Через 5 мин осадок отфильтровывают, в фильтрате остается яичный альбумин. Для высаливания альбуминов к фильтрату добавляют порошок сульфата аммония до полного насыщения, т. е. пока новая порция порошка остается нерастворенной. Выпавший осадок альбумина отфильтровывают. С фильтратом проделывают биуретовую реакцию. Отрицательная реакция указывает на отсутствие белка.

Выводы по результатам работы.

_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

_

_

Рекомендуемая литература

Основная

1 Кухта, В. К и др. Биологическая химия: учебник / , , ; под ред. . – Минск: Асар, М.: Издательство БИНОМ, 2008. – С. 45-46, 54-60.

2 Биохимия: Учебник для вузов / Под ред. . – 4-е изд., испр. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2006. – С. 9-73, 75-80, 83-92.

3 Филиппович, Ю. Б. Основы биохимии. – 4-е изд. – М.: Агар, 1999. – С. 49-78, 95-105.

4 Николаев, А. Я. Биологическая химия. М.: Медицинское информационное агентство, 2004. – С. 61-63, 68-78.

5 и др. Биохимия человека: в 2-х т.: Пер. с англ., М.: Мир, 2004. – Т.1: С. 47-51, 63-66, 79-81.

Дополнительная

6 Березов, Т. Т. Биологическая химия / , . – М.: Медицина, 1998. – С. 114-143.

7 Ленинджер, А. Л. Основы биохимии. М.: Мир, 1985. Т. 1. С. 226–302.

8 , Биоорганическая химия, М.: Медицина, 1991. С. 313–376.

9 и др. Молекулярная биология клетки. М.: Мир, 1994. Т. 1. С. 113–171.

Занятие 4

Ферменты-2. Механизм действия ферментов

Цель занятия: закрепить знания по структуре ферментов, сформировать представления о механизме действия ферментов. Научиться выполнять качественные реакции на активность некоторых гидролитических ферментов.

Исходный уровень знаний и навыков

Студент должен знать:

1 Теоретические основы химической кинетики.

2 Строение моносахаридов. Качественные реакции на альдегидные и спиртовые группы.

3 Строение полисахаридов. Свойство и качественные реакции.

4 Механизм образования шиффовых оснований.

5 Строение и механизм катализа коферментами NAD+ и NADP+.

Студент должен уметь:

1 Проводить качественные реакции на продукты ферментативного гидролиза.

Структура занятия

1 Теоретическая часть

1.1 Свойства ферментов (термолабильность, специфичность и др.). Механизм действия ферментов. Этапы взаимодействия фермента и субстрата. ишера, Д. Кошланда и современные взгляды.

1.2 Теория промежуточных соединений. Основы термодинамики катализа. Энергия активации. Энергетический барьер.

1.3 Кинетика ферментативных реакций (факторы, влияющие на скорость ферментативных реакций: природа фермента и субстрата, их концентрация, pH, температура, лекарственные препараты и др.). Константа Михаэлиса (Km) – определение, физическое значение.

1.4 Регуляция активности ферментов. Роль гормонов, цАМФ, активаторов, ингибиторов.

1.4.1 Регуляция активности путем химической модификации ферментов (ограниченный протеолиз, фосфорилирование, метилирование и др.).

1.5 Виды ингибирования.

1.6 Аллостерическая регуляция. Свойства аллостерических ферментов.

2 Практическая часть

2.1 Решение задач и проведение контроля конечного уровня знаний.

2.2 Лабораторные работы.

Задачи

1   При увеличении концентрации субстрата скорость ферментативной реакции...

а)  сначала возрастает, затем падает;

б)  не изменяется;

в)  сначала возрастает, затем стабилизируется на постоянном уровне;

г)  непрерывно возрастает пропорционально концентрации субстрата;

д)  сначала убывает, затем возрастает?

2   Температурный оптимум для большинства ферментов находится в диапазоне:

а) от 36 до 38°C; б) от 40 до 44°C; в) от 30 до 34°C; г) от 0 до 8°C?

3   Энергия активации – это…

а)  энергия, необходимая для перевода всех молекул фермента в активированное состояние;

б)  энергия, необходимая для перевода всех молекул субстрата в активированное состояние;

в)  разница величин энергий субстратов и продуктов реакции;

г)  общая энергия системы?

4   Взаимодействие, описываемое выражением «как рука к перчатке»:

а)  субстрат + активный центр;

б)  ингибитор + активный центр;

в)  регулятор + аллостерический центр;

г)  якорная площадка + каталитическая площадка?

5   Активность ЛДГ при увеличении температуры с 30 до 40°C:

а) не изменится; б) станет равной нулю; в) уменьшится в 2-4 раза; г) увеличится в 2-4 раза; д) возрастет в 10 раз?

6   Активность АсАТ при постепенном изменении температуры с 30 до 70°C:

а) сначала увеличится, затем резко снизится; б) не изменится; в) увеличится в среднем в 32 раза; г) немедленно упадет до нуля; д) будет постепенно нарастать?

7   Константа Михаэлиса – это…

а)  молярный коэффициент экстинкции фермента;