Многоканальный наконечник для экстракции нуклеиновых кислот, белков и пептидов (стр. 3 )

6.Нагреваем до температуры размягчения стекла и перетягиваем пакет в 10 раз в шестигранные заготовки с размером диагонали 6,0 мм, размер стороны 3 мм, размер по двойной апофеме 5,3 мм, количество каналов (2107*91=191737), диаметром 10 мкм.

7. Укладываем, полученные (в пункте 3), шестигранные заготовки в трехгранный пакет, общее количество шестигранников в пакете 15, на стороне трехгранника 5 шестигранников, рассчитывается исходя укладки предыдущего (пункт 5.) шестигранного пакета, у которого на диагонали 11 шестигранников, тогда на стороне трехгранного пакета будет (11-1)/2=5 шестигранников, размер стороны 27,5 мм, размер высоты трехгранного пакета 23,8 мм.

8. Нагреваем до температуры размягчения стекла и перетягиваем пакет в 10 раз в трехгранные заготовки с размером стороны 2,7 мм, и высоты 2,4 мм, количество каналов 31605 диаметром 10 мкм.

9.Запаиваем один торец 91 шестигранника, полученных в пункте 6. и 180 трехгранника, полученных в пункте 8.

10. Укладываем окончательный пакет: 11 шестигранников на диагонали выстроены диагоналями друг к другу 6 шестигранников на стороне всего в пакете 91 шестигранника и 180 трехгранника, которые уложены в углы шестигранников, образуя укладку в виде «звезды Давида», шестиконечной звезды, или гексаграммы. Таким образом, получен шестигранный пакет: размером по диагонали 6*11=66 мм, размер по двойной апофеме 57,2 мм, количество каналов (191737*91=17448067) в шестигранниках и (31605*180=5688900) общее количество -23136967 диаметром 10 мкм. Собранный пакет помещают в стеклянную трубку наружным диаметром 70 мм и внутренним 67 мм.

11. Перетягиваем собранный пакет, например в 10 раз, получая структуру для МК наконечника, наружным диаметром 7 мм, диаметром каналов 1 мкм количеством 25602157. Если необходимо получить, например диаметр канала 500 нм, структуру перетягивают в 20 раз - наружный диаметр при этом становится 3,5 мм. Для получения 100 нм диаметра канала пакет перетягивают в 100 раз, наружный диаметр при этом будет составлять 700 мкм.

Пример 2

Стеклянную многоканальную структуру с размером по двойной апофеме 50 мм и диаметром каналов 650 мкм, обложенную одним рядом обрамления, причем в углах капиллярной структуры вместо многоканальных капилляров вставлены три стеклянных стержня обрамления, перетягивают до диаметра каналов 40 мкм и наружного размера 3.35 мм. В регулярной гексагональной капиллярной структуры три угловых капилляра заменены на стеклянные стрежни, что позволяет предельно предохранить структуру от деформации при перетяжке. Получают многоканальный наконечник, содержащий 4417 капилляров с диаметром 40 мкм, толщина многоканальной системы при этом составляет 3.35 мм, длина 50 мм.

Пример 3

Блок стекла обертывают термостойкой тканью, устанавливают на фильерный узел, который находится в печи. Далее блок разогревают до температуры размягчения. Затем через фильерный узел размягченное стекло продавливается под собственным весом и направляется вниз, где изделие зажимают в механизм вытяжки. Таким образом, производится вытягивание трубки (причем внутренние размеры трубки соответствуют геометрии и размерам многоканального элемента). Форма поперечного сечения изделия и его размеры определяются геометрией фильерного узла, скоростью вытягивания и температурой размягчения стекла. Стабильность и точность поддержания температуры в печи и скорости вращения привода вытяжки во многом определяют стабильность и точность геометрических размеров, поперечного сечения получаемого изделия.

Пример 4

Для модификации капилляров длиной 30 мм с диаметром капилляров 30 мкм полианилиновым покрытием 1.3 моля анилина растворяли в 8 мл 1M HCl. Отбирали 200 мкл полученного раствора и охлаждали до 10-11°С. Добавляли 60 мкл водного раствора окислителя (персульфата аммония, 5 % мас.). В многоканальный наконечник набирали реакционную смесь и инкубировали 20 мин при комнатной температуре. По окончании полимеризации наконечник промывали водой, этанолом и сразу же высушивали в сушильном шкафу при 80°С в течение 4 ч.

Пример 5

Проводили модификацию как в примере 2. После промывки водой процедуру нанесения полимерного покрытия повторяли еще дважды. По окончании полимеризации многоканальные наконечники промывали водой, этанолом и сразу же высушивали в сушильном шкафу при 80°С в течение 4 ч.

Пример 6

Для модификации капилляров покрытием сополимера анилина с 3-аминобензойной кислотой мономеры (0.975 моль и 0.325 моль, соответственно) растворяли в 8 мл 1M HCl. Раствор охлаждали до 10-11°С и добавляли 60 мкл водного раствора окислителя (персульфата аммония, 5% мас.). В каждый многоканальный наконечник набирали реакционную смесь и инкубировали 20 мин при комнатной температуре. По окончании полимеризации многоканальные наконечники промывали водой, этанолом и сразу же высушивали в сушильном шкафу при 80°С в течение 4 ч.

Пример 7

Модифицированные полимерами многоканальные наконечники использовали для одностадийной очистки и выделения ДНК из клинического образца крови. 100 мкл крови с ЭДТА (100 мкл) вносили в микропробирку типа Eppendorf. Добавляли 100 мкл лизирующего буфера, перемешивали и инкубировали 15 мин при 95° С. Лизат центрифугировали 10 мин при 10000 об/мин (3.584 kg), затем в многоканальный наконечник отбирали супернатант и инкубировали 2 мин при комнатной температуре. Элюат из многоканального наконечника переносили в чистую пробирку и затем анализировали методом ПЦР в реальном времени. Лизис пробы, процедуры очистки ДНК с помощью коммерческих колонок и наборов для ПЦР проводили как в [D. V. Kapustin, A. I. Prostyakova, D. Yu. Ryazantcev, V. P. Zubov. Novel composite matrices modified with nanolayers of fluoropolymers as perspective materials for separation of biomolecules and bioanalysis. Nanomedicine. Vol. 6(2), (2011). P. 241-255.].

Результаты ПЦР представлены в таблице 1:

Пример 8

100 мкл модельной смеси, содержащей ДНК тимуса теленка (10 мкг) и бычий сывороточный альбумин (550 мкг) вносили в пластиковую микропробирку объемом 1.5 мл. Многоканальный наконечник промывали несколько раз аликвотой модельной смеси (100мкл в пробирке Eppendorf), затем набирали аликвоту в носик и инкубировали при комнатной температуре 3 мин. Элюат из многоканального наконечника переносили в чистую пробирку и анализировали электрофоретически. Результаты электрофореза представлены на фиг. 1 (фиг. 1 - электрофорез в 0.8% агарозном геле. 1 – маркер, 2 – исходная смесь ДНК-белок, 3 – элюат из многоканального наконечника без инкубирования (только двухкратное промывание), 4 – элюат из многоканального наконечника после промывания и инкубации (3 мин). Полученные элюаты также анализировали спектрофотометрически, определяя поглощение при 260 и 280 нм. Полученные данные приведены в таблице 2. Видно, что очищенная от белка ДНК практически полностью содержится в элюате.

Пример 9

Предварительно определяли емкость капиллярного наконечника по белку (БСА), которая составила 400 ± 10 мкг. Для демонстрации эффекта обратимого удерживания белков в многоканальный наконечник длиной 5 см с капиллярами с диаметром 30 мкм с помощью механического дозатора втягивали 100 мкл раствора БСА (550 мкг) в ТЭ-буфере (рН 7.2). Затем аликвоту переносили в пластиковую пробирку и анализировали спектрофотометрически, определяя по калибровочной кривой содержание белка в пробе. После этого в многоканальный наконечник втягивали 100 мкл ТЭ-буфера (рН 10.0) и снова переносили полученный элюат и анализировали спектрофотометрически. Полученные результаты представлены в таблице 3. Анализ полученных данных свидетельствует о том, что удерживаемый при нейтральных значения рН среды белок практически полностью десорбируется с поверхности капилляра при повышении рН.

При использовании модифицированного наконечника от 48% до 71% ДНК сохраняется. Препарат существенно очищается от примесей по сравнению с исходным образцом. Значение 260нм/280нм равно в среднем 1,64 (у исходного препарата – 1,38). Препарат выделенной ДНК очень чистый. Требуется увеличить время экспозиции в наконечнике для большей очистки.

При использовании традиционной методики при высокой чистоте препарата выделенной ДНК (в среднем значение 260нм/280нм равно 1,83) наблюдались большие потери препарата в результате двух отмывок – в среднем сохраняется 33%-43% ДНК. Кроме того, процедура выделения более длительная и требует дополнительного оборудования и ресурсов (реактивов из набора) по сравнению с использованием модифицированных МК-наконечников.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Многоканальный наконечник для выделения нуклеиновых кислот, белков, пептидов, расположенный в корпусе полипропиленового наконечника для пипеток, состоящий из стеклянного гексагонального многоканального массива, включающего многоканальные элементы из множества параллельных капилляров, на внутренней поверхности которых нанесен сорбционный слой, отличающийся тем, что сорбционный слой состоит из от одного до трех полимерных нанослоев, образующихся в результате проведения осадительной окислительной полимеризации анилина или его сополимеризации с 3- аминобензойной кислотой и имеющих толщину от 3 до 10 нм, а многоканальный элемент выполнен с защитным обрамлением из нескольких рядов стеклянных стержней, при этом единичный стеклянный шестигранный стержень имеет оболочку из легкоплавкого стекла, а стеклянный гексагональный многоканальный массив состоит из уложенных многократно вытянутых единичных многоканальных элементов с диаметром капилляров от 1 мкм и более, рабочей поверхностью до 500 см2, объемом до 500 мкл и дополнительных поверхностей в виде межканальных отверстий меньшего диаметра, при этом защитное обрамление выполнено в виде трубки, внутренняя геометрия которой выполнена под размеры и форму многоканального элемента.

2. Многоканальный наконечник по п. 1, отличающийся тем, что в гексагональном многоканальном массиве от трех до шести угловых многоканальных элементов заменены на стеклянные шестигранные стержни.

3. Многоканальный наконечник по п.1, отличающийся тем, что трубка, внутренняя геометрия которой соответствует размерам и форме многоканального элемента, получена вытяжкой из расплава из более легкоплавкого стекла, чем многоканальный элемент, причем коэффициент термического расширения трубки соответствует коэффициенту термического расширения многоканального элемента.