Многоканальный наконечник для экстракции нуклеиновых кислот, белков и пептидов (стр. 1 )

МНОГОКАНАЛЬНЫЙ НАКОНЕЧНИК ДЛЯ ЭКСТРАКЦИИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ, БЕЛКОВ И ПЕПТИДОВ

410069, а, кв. 83

410044, г. Саратов, ул. Студеная,

410012 г. Саратов, Пр. Им 8, кв. 39

117465, г. Москва, ул. Генерала Тюленева, .

117321, ,

РЕФЕРАТ

Изобретение относится к области молекулярной биологии, к аналитической химии, фармакологической биотехнологии, а именно, к многоканальным устройствам, модифицированным нанослоями анилинсодержащих полимеров, и к технологии твердофазной экстракции нуклеиновых кислот, белков, пептидов на основе многоканальных структур, модифицированных слоями полимеров, и может быть использовано в процедурах одностадийного разделения смесей, содержащих нуклеиновые кислоты, белки, пептиды при выделении указанных компонентов из биологических образцов для последующего проведения молекулярно-биологических исследований в лабораториях молекулярно-генетического профиля.

Представлен биосепарирующий элемент, содержащий модифицированную анилинсодержащим полимером стеклянную многоканальную систему, впаянную в наконечник для механического дозатора. Применение анилинсодержащего полимерного модификатора позволяет проводить быстрое одностадийное выделение и очистку нуклеиновых кислот (ДНК, РНК), а также разделять компоненты белковой природы в зависимости от значения их пьезоэлектрической точки (рI) без добавления дополнительных органических компонентов в подвижную фазу и без использования дополнительного оборудования (насосы, центрифуги и т. д.).

7 п. ф-лы, 5 ил., 3 таб.

МПК

B81B 7/00

МПК

C12N 15/00

МПК

C07K 1/00

МНОГОКАНАЛЬНЫЙ НАКОНЕЧНИК ДЛЯ ЭКСТРАКЦИИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ, БЕЛКОВ И ПЕПТИДОВ

Изобретение относится к области молекулярной биологии, к аналитической химии, фармакологической биотехнологии, а именно, к многоканальным устройствам, модифицированным нанослоями анилинсодержащих полимеров, и к технологии твердофазной экстракции нуклеиновых кислот, белков, пептидов на основе многоканальных структур, модифицированных слоями полимеров, и может быть использовано в процедурах одностадийного разделения смесей, содержащих нуклеиновые кислоты, белки, пептиды при выделении указанных компонентов из биологических образцов для последующего проведения молекулярно-биологических исследований в лабораториях молекулярно-генетического профиля.

Известны различные микроколоночные методы биосепарации, основанные на использовании спин-колонок или картриджей, пропускание через которые мобильной фазы (т. е. элюента) осуществляют за счет воздействия центробежной силы в центрифуге. Такие микроколонки содержат немодифицированные кремнеземы, модифицированные кремнеземы (с использованием низкомолекулярных и высокомолекулярных модификаторов), синтетические мембраны, полимерные монолиты, полимерные или стеклянные капилляры и т. д.

Как правило, способы разделения и выделения биополимеров основаны на различной растворимости нуклеиновых кислот, белков и полисахаридов. Несмотря на их эффективность, большинство методов разделения многостадийны, трудоемки и часто сопровождаются потерями выделяемого компонента. Это является следствием того, что такие методы основываются на концепции «улавливания» и «удерживания» целевого биополимера сорбентом из смеси на первом этапе разделения с последующей отмывкой от примесей и элюцией целевого компонента из сорбционного материала на последующих этапах.

Известен способ и устройство для молекулярной сепарации и экстракции нуклеиновых кислот US 7.943.393 B2 и US 6.451.260 B1, в котором используют спин-колонки, в виде полипропиленовой трубки с одним или несколькими слоями адсорбента (стекловолокна, стеклянных шариков, полимерных гранул, частиц кремнезема, модифицированных силанами или полимерами и т. д.). В этом патенте представлена реализация классического многостадийного принципа сепарации биомолекул на основе спин-колонок (картриджей), содержащих сорбционный материал, обратимо удерживающий целевой сорбат. Пропускание образца и элюентов (буферных растворов) через спин-колонку (следующим за этапом инкубации) осуществляется путем ее раскручивания на центрифуге до определенной скорости или под действием пониженного или избыточного давления. Процесс выделения, очистки нуклеиновой кислоты в этих случаях основан на способности нуклеиновых кислот обратимо адсорбироваться на поверхности сорбента. Таким образом, спин-колонки имеют, по крайней мере, два существенных недостатка: необходимость использования центрифуги (или специального насоса) и дороговизна автоматизации процесса выделения (очистки) вследствие многостадийности процесса. Кроме того, следует отметить, что такой традиционный подход к выделению нуклеиновых кислот исключает возможность одновременного выделения суммарной белковой фракции (тем более отдельных фракций белков или пептидов) из образца (за счет низкой в этих случаях селективности поверхности адсорбента).

Изготовление многоканальных структур реализуется по волоконной технологии, классические моменты которой описаны в ряде книг [, «Волоконная оптика», Москва, 1965; «Волоконная оптика, принципы и применения», Лондон, 1967]. Известные способы волоконной технологии включают изготовление многоканальных структур за счет вытяжек стеклянных трубок, укладки и вновь перетяжки до уменьшения диаметров каналов с последующим спеканием, например GB-PS 1.064.072. В устройстве по патенту US-PS 4.127.398 изложен способ изготовления многоканальных трубчатых структур, где описывается сборка трубок в пакет определенного поперечного сечения, многократная перетяжка в гексагональную структуру до требуемых геометрических размеров, заполнение газом с одновременной запайкой торцов и спекания в трубке. В US–PS 4.010.019, US–PS 4.127.398 описываются сборка трубок, нагрев, перетяжка и формование гексагональной структуры. Известен способ изготовления патент РФ RU№ 000 и DE 4.411.330 A1, в котором изложен способ изготовления многоканальной жесткой структуры или элемента. Способ включает сборку стеклотрубок в пакет-заготовку, закрепление одного конца в захвате узла подачи, нагревание в печи другого конца с образованием луковицы, и формование, отличающийся тем, что в процессе формования осуществляется образование цилиндрической части структуры или элемента путем герметизации пакета стеклотрубок с последующей усадкой при разрежении, а затем вытягивание стекломассы вверх или вниз в зависимости от заданной формы боковой поверхности.

Недостатками известных технических решений являются: технологические проблемы в получении однородных структур с высокой степенью регулярности укладки. Не решены проблемы пограничной деформации капилляров в пакете. При перетяжках возникают разрывы структуры, что недопустимо для многих применений. Технология изготовления, описанная выше, не позволяет получать структуры с диаметрами каналов менее 1 мкм из-за проблем с укладкой шестигранных элементов, сторона которых становится рифленой, и укладывать такие структуры с соблюдением условий регулярности невозможно, поскольку появляется сдвиг укладываемых структур.

В патенте US 7.118.671 B2 описана поликапиллярная хроматографическая колонка и способ ее изготовления. Согласно этому патенту, поликапиллярная хроматографическая колонка содержит множество изолированных друг от друга параллельных каналов, стенки которых с внутренней стороны покрыты сорбентом, а наружными сторонами сплавлены со стенками соседних каналов. Особенностью колонки является то, что она выполнена в виде совокупности модулей различного уровня, при этом модуль самого низкого уровня представляет собой гексагонально упакованную и имеющую в поперечном сечении вид правильного шестиугольника совокупность каналов, являющуюся результатом совместного вытягивания пучка капилляров в размягченном состоянии. Модуль каждого более высокого уровня представляет собой гексагонально упакованную и имеющую в поперечном сечении вид правильного шестиугольника совокупность модулей предыдущего уровня, являющуюся результатом их совместного вытягивания в размягченном состоянии. Способ изготовления колонок заключается в осуществлении нескольких стадий вытягивания пакетов заготовок, каждая из которых является результатом вытягивания на предыдущей стадии и разрезания получаемого при вытягивании изделия на части определенной длины - заготовки. Недостатком этой конструкции и технологии является низкие пористость и прочность структуры.

Выше изложенные способы не позволяют получать однородные структуры с хорошими границами спекания, в структурах наблюдаются деформации каналов, сдвиг укладки, низкая пористость из-за наличия множества обрамлений единичных блоков и отсутствие гарантированной защитной оболочки структуры в целом.

В патенте РФ RU№ 000 описано устройство, которое может быть использовано в средствах для перекачивания малых количеств жидкости, без движущихся механических частей, использующих электрокинетический эффект. Микронасос содержит поликапиллярную структуру из неэлектропроводного материала со сквозными микроканалами, входы и выходы которых, образуют входной и выходной торцы структуры. Такая структура, может быть изготовлена, например, по технологии, описанной в патентах RU № 000, DE 4.411.330, US 3.923.426, RU № 000.

Наиболее близкими к предлагаемому решению является United States Patent Application Publication US 2007/0017870 A1 и US 2011/0092686 А1, в которых представлены наиболее эффективные методы разделения/выделения/очистки биополимеров, основанные на применении мультикапиллярных систем, модифицированных нанопокрытиями специфических полимеров или низкомолекулярных модификаторов.

В них для разделения и очистки нуклеиновых кислот на внутренние поверхности стенок каждого капилляра наносят нерастворимый сорбционный материал, а затем монолитный капиллярный элемент устанавливают в соответствующий корпус полимерного наконечника. Для работы мультикапиллярное устройство используют со стандартными пипетками, шприцами или аналогичными аналитическими инструментами.