Спецпрактикум кафедры химической энзимологии Задача 4. Применение иммобилизованных ферментных препаратов в биотехнологии и медицине (стр. 4 )

Физико-химические методы контроля свойств частиц

Для контроля свойств полиэлектролитных капсул и/или роста полиэлектролитных слоев на сферической матрице при синтезе частиц используют ряд физико-химических методов, светорассеяние, электрофоретическая подвижность, за структурой частиц обычно следят методом атомно-силовой микроскопии. 

Метод лазерной сканирующей микроскопии (или флуоресцентной микроскопии) используется для наблюдения в реальном времени и в условиях in vivo за свойствами нанокапсул, их подвижностью, проникающей способности, поглощения клеткой, и доставкой инкапсулированных материалов.

Контролируемая доставка и выброс лекарства. Механизм контролируемого выброса лекарства основан на разрушении или регуляции проницаемости оболочки нанокапсул с применением физических методов (свет, ультразвук, радиоволны).

Рис. 9. Контролируемый выброс лекарства путем разрушения нанокапсулы под воздействием лазерного света. (i) Направленный лазерный луч вызывает локальный нагрев частиц коллоидного золота (содержащихся в нанокапсуле), что приводит к светоразрушению капсулы и высвобождению инкапсулированного материала.

Таким образом, многослойные полиэлектролитные капсулы являют собой мультифункциональные наносистемы, с четко регулируемыми свойствами. 

Инкапсулирование альгинат-хитозан. Основная область применения - для доставки лекарств, инкапсулирование обеспечивает устойчивость лекарств (в том числе, белков) к био - и кислотной деградации в желудочно-кишечном тракте, а также пролонгированое действие лекарств.

Одним из наиболее широко применяемых методов для придания требуемых свойств лекарственным средствам на основе белков является инкапсулирование биоактивных молекул с использованием альгината, каррагинана, коллагена, желатины, целлюлозы, а также некоторых синтетических полимеров. Белки включенные в такие частицы характеризуются высокой биологической и термостабильностью, устойчивостью к изменению рН, улучшенным (в том числе, более пролонгированным) лечебным эффектом и возможностью направленной доставки.

Существует два принципиально различных способа инкапсулирования биомолекул. Первый способ – метод внешнего гелеобразования. Раствор альгината, содержащий инкапсулируемый материал (белок) с помощью специального «микроразбрызгивателя» вносят в раствор хлорида кальция. «Микроразбрызгиватель» - (или пульверизатор) позволяет получать однородные капли заданного размера. При контакте альгината с ионами кальция немедленно образуются сферические полимерные белок-содержащие частицы. Гелеобразование происходит в направлении от поверхности к центру частиц. Поэтому рассматриваемый метод называют способ внешнего гелеобразования.

Рассмотрим метод внутреннего гелеобразования при инкапсулировании биомолекул с использованием альгината (рис. 10). Иммобилизацию биомолекул на частицах альгината проводят следующим образом: к раствору альгината добавляют твердый измельченный карбонат кальция. Полученную смесь эмульгируют в растительном масле, содержащем ПАВ (SPAN 80). Гелеобразование инициируют понижением рН системы (добавлением 0.2% уксусной кислоты). Частицы геля промывают от масла. На полученных сферических частицах адсорбируют фермент, после чего  покрывают пленкой хитозана по механизму электростатического комплексообразования.

Вопросы студентам:

1) при каких значениях рН (интервал) следует проводить адсорбцию фермента? наносить на фермент-содержащие частицы хитозановое покрытие?

2) Как можно определить эффективность (выход) инкапсулирования (по ферменту?)

Рис. 10. Инкапсулирование ферментов на альгинат-хитозановых частицах.

В заключении отметим, преимуществом инкапсулирования методом внутреннего гелеобразования путем эмульгирования является возможность получения частиц заданного размера, варьированием условий (содержания воды, ПАВ в системе).

Включение ферментов и других биологически активных молекул в липосомы

Искусственные липопротеидные комплексы, липосомы, обращенные мицеллы, часто применяются в биологии для изучения мембраноактивных белков и моделирования различных ферментативных, транспортных и рецепторных функций клеточных мембран. Липосомы часто используют в медицине и косметике, поскольку такие системы по своим свойствам близки к природным мембранам. Основное применение липосом в области медицины – создание биосовместимых носителей для направленной доставки биоактивных молекул, лекарств.

Липосомы представляют собой частицы, которые образованы одним или несколькими концентрическими замкнутыми липидными бислoями, внутренний объем которых изолирован от внешней среды. В зависимости от размера частиц и числа образующих их липидных слоев различают следующие липосомы: 1) малые моноламеллярные, образованные одиночным липидным бислоем (диаметр 20-50 нм); 2) крупные моноламеллярные (макровезикулярные), образованные также одиночным бислоем (диаметр 50-200 нм и выше); 3) многослойные (мультиламеллярные), насчитывающие до неск. десятков и даже сотен липидных бислоев (диаметр до 5000-10000 нм) (рис. 11).

Рис. 11. Липосомы могут быть однослойными (диаметр 20- 50 нм) и многослойными (5 -50 микрометров). Заштрихованные зоны – место нахождения воды, светлые – бимолекулярный липидный слой, «хвосты» составляющих его молекул обращены внутрь слоя.

Один из способов получения фермент-содержащих липосом заключается в том, что раствор липида в органическом растворителе впрыскивают с помощью микро-шприца в воду или водный солевой раствор при температуре, несколько превышающей точку кипения растворителя. После испарения растворителя в токе инертного газа происходит самопроизвольное образование (самосборка) бислойных пузырьков, липосом, содержащих включенный фермент.

В другом варианте раствор липида (например, лецитина) в органическом растворителе (например, в хлороформе) упаривается в вакууме. Липид остается на стенках колбы в виде тонкой пленки. Затем в колбу вносят раствор фермента, встряхивают и выдерживают в течении некоторого времени. В полученной системе происходит самосборка мультиламеллярных липосом, содержащих включенный фермент. Для удаления невключившегося фермента липосомы отделяют центрифугированием и ресуспендируют в водном буферном растворе.

Моноламеллярные липосомы получают из мультиламеллярных ультразвуковой обработкой. Недостатком таких систем являются их недостаточная устойчивость, что сужает область их практического применения в медицине.

В последние годы применяют способ получения фермент-содержащих липосом путем включения ферментов в полимерные липосомы. Для получения липосом в этом случае используются липиды, модифицированные путем введения в их молекулу кратной связи. После включения фермента в липосомы, приготовленные из модифицированных молекул липидов, проводят полимеризацию липидных молекул (например путем облучения ультрафиолетовым светом в присутствии инициатора). Образуются ковалентно сшитые замкнутые липидные бислойные мембраны. Полимерные липосомы обладают гораздо более высокой стабильностью по сравнению с обычными.

Липосомы часто применяются в биологии для изучения мембраноактивных белков и моделирования различных ферментативных, транспортных и рецепторных функций клеточных мембран. Липосомы очень хорошо зарекомендовали себя в качестве модельной системы при изучении свойств биомембран. Липосомы позволяют воссоздавать элементы биологических структур непосредственно из материала биологических мембран. Было обнаружено, что отделенные от биомембран мембранные ферменты после включения в липосомы обнаруживают сходные со связанным на биомембране ферментом физические и каталитические свойства.

В настоящее время липосомы применяются в экспериментальной медицине и косметике как одно из основных средств доставки биоактивных молекул и лекарственных средств. Многие липосомальные препараты дошли до клинических испытаний и некоторые из них лицензированы и применяются. Применение липосом имеет ряд существенных преимуществ перед другими носителями лекарств. Прежде всего, это биосовместимость, что обусловлено сходством с природными мембранами клеток по химическому составу: мембрана липосом состоит из природных фосфолипидов. И при правильном подборе компонентов липосом их введение в организм не вызывает негативных реакций.

Второе важное свойство липосом – это универсальность. Благодаря полусинтетической природе можно широко варьировать их размеры, характеристики, состав поверхности. Кроме того, вещество, заключенное в липосомы, защищено от воздействия ферментов, что увеличивает эффективность препаратов, подверженных биодеструкции в биологических жидкостях. Это позволяет использовать липосомы в качестве носителей для широкого круга фармакологически активных веществ: противоопухолевые и противомикробные препараты, гормоны, ферменты, вакцины, а также дополнительные источники энергии для клетки, генетический материал.

В-третьих, липосомы сравнительно легко разрушаются в организме (они биодеградируемы), высвобождая доставленные вещества. В процессе доставки лекарств липосомы, сами лишенные свойств антигена, экранируют включенные в них биоактивные молекулы от контакта с иммунной системой, не вызывая защитных и аллергических реакций организма. Еще одно важное преимущество липосом как лекарственной формы - постепенное высвобождение лекарственного вещества, инкорпорированного в них, что увеличивает время его действия.

Особую роль играет характер взаимодействия липосом с клетками, который может принимать различные формы: самая простая – липосомы адсорбируются на клеточной поверхности. При определенных условиях липосомы могут поглощаться клетками, их мембрана может сливаться с клеточной мембраной, что приводит к внутриклеточной доставке их содержимого (рис. 12).

Рисунок 12. Способы проникновения содержимого липосом в клетку (из работы , Ле Банг Шон, , . Вопросы медицинской химии. 1999. Том 45. выпуск 1).