Спецпрактикум кафедры химической энзимологии Задача 4. Применение иммобилизованных ферментных препаратов в биотехнологии и медицине (стр. 6 )

Одним из путей повышения эффективности лекарственных препаратов белковой структуры является "пегилирование" - химическая модификация белков полиспиртами, полиэтиленгликолем (ПЭГ) и блоксополимерами (пролиэтилен - и полипропиленгликоля), плюрониками и проксанолами. полиэтиленгликолем (ПЭГ). Подобная химическая модификация фармакологических препаратов белковой природы направлена на улучшение их переносимости, снижение иммуногенности, повышение периода их полужизни.

В настоящее время ПЭГ одобрен Управлением по питанию и лекарственным препаратам США (FDA) в качестве субстанции, разрешенной к использованию в медицине (производство лекарственных препаратов), продуктах питания и косметологии.

Для пегилирования белков применяется метод образования нековалентных аддуктов, образующихся в условиях инкубирования смеси белка и ПЭГ в условиях повышенного давления, а также ковалентная модификация по аминогруппам белка. При этом удобно использовать моноальдегидные производные полиспиртов, например:

       ПЭГ (1) - СН3(ОСН2СН2)44ОСН2СНО;

       ПЭГ (2) - СН3(ОСН2СН2)16ОСН2СНО;

       Проксанол (1) - С4Н9[OCH(CH3)CH2]14(OCH2CH2)20OCH2CHO;

       Проксанол (2) - С4Н9(OCH2CH2)20[OCH(CH3)CH2]14OCH(CH3)CHO.

Молекулы ПЭГ могут иметь различную молекулярную массу и стереохимическую структуру. Молекулярный вес молекул ПЭГ может колебаться в пределах 300 - 4000 Дальтон, а выстроенные в цепи макромолекулы ПЭГ могут формировать как разветвленную, так и линейную стереохимию. Именно масса ПЭГ и его стереохимическая структура, как правило, определяют принципиальные свойства будущего модифицированого белкового субстрата. В основном более длинные цепи ПЭГ обуславливают большую продолжительность периода полужизни коньюгата "ПЭГ - пептид" и его фармакологическую стабильность. Другим важным фактором, влияющим на фармакодинамику и фармакокинетику ПЭГ - модифицированных белков, является структура ПЭГ - цепочек: разветвленная молекула ПЭГ формирует замедление активного метаболизма препарата, что также влечет за собой удлинение времени активной циркуляции препарата. С разветвленной структурой цепочек ПЭГ связана также и значительно меньшая иммуногенность модифицированных препаратов при сохранении их основных фармакологических свойств. Подобные эффекты могут быть достигнуты и другим путем - связыванием пептида, например, не одной, а несколькими молекулами ПЭГ, имеющими при этом линейную структуру цепочек. Хорошо изученным примером в этой связи является молекула интерлейкина - 2 (ИЛ - 2). Так как молекула ИЛ - 2 очень мала, последняя свободно фильтруется через почки и имеет очень короткий период полужизни. Соединение ИЛ - 2 с ПЭГ, имеющей молекулярную массу менее 20 kDa, практически никак не влияет на фармакодинамику белка, но повышение молекулярной массы ПЭГ до 60 - 70 кДа уже значительно замедляет фильтрацию коньюгата "ПЭГ - ИЛ - 2" и увеличивает его время полужизни и биологическую доступность.

Одно из важнейших свойств модифицированных ПЭГ - молекул - высокая гидрофильность, формирующая принципиально новые физико-химические свойства модифицированного белка. При модификации белка молекулами ПЭГ происходит формирование "водного облака" вокруг модифицированной молекулы "ПЭГ - белок", за счет чего значительно повышается гидродинамический радиус коньюгата. Этот своеобразный "щит" воды вокруг модифицированной молекулы белка с одной стороны значительно повышает растворимость и биодоступность препарата, с другой - защищает молекулу от других белков (нейтрализующие антитела, комплемент). Таким образом ПЭГ - модифицированные пептиды значительно более защищены от опсонизации (взаимодействия с белками плазмы – опсонинами, которые "метят" чужеродные компоненты, делают их мишенями для клеток ретикулоэндотелиальной системы РЭС) и активного фагоцитоза клеточных структур макроорганизма.

ПЭГ - модификация белковых препаратов, привнесла серьезные изменения в результаты лечения при таких заболеваниях, как ферментные дефициты, лейкемия, хронические воспалительные заболевания, онкология, хронические вирусные инфекции, кардиоваскулярная патология. Например Пегинтерферон альфа-2b применяется в противовирусной терапии, индуцирует подавление репликации вирусных ДНК или РНК, что и определило его широкое применение при лечении хронических вирусных гепатитов B и С. Данный препарат уже прошел все необходимые клинические испытания и зарегистрирован к применению во всех ведущих европейских странах (в том числе и России) и США под коммерческим названием ПегИнтрон. На рисунке 2. представлены профили фармакокинетики двух препаратов: нативного интерферна альфа-2b (Б) и пегилированного его коньюгата ПегИнтрона (А). Очевидно, что ПегИнтрон имеет значительно лучший биологический профиль, по сравнению со стандартным интерфероном альфа-2b; это выражается значительным повышением периода полужизни пегилированого аналога, снижением его иммуногенных свойств. Период "эффективной" полужизни препарата составляет в среднем около 40 часов! Для ПэгИнтрона характерен баланс между противовирусной активностью и длительным периодом полувыведения, позволяющим назначать препарат один раз в неделю, а также эффективно выводить метаболиты ПЭГ из организма.

               10        20        30        40        50        60        70        80        Время, часы

Рис. 19. Фармакокинетический профиль стандартного (Б) и пегилированного интерферона альфа-2b (А) (Из обзора , . 2001. Пегилированные лекарственные преапраты: современное состояние проблемы и перспективы. (www.hepatit.ru))

Таким образом, пегилирование лекарственных препаратов пептидной структуры имеет ряд весомых и несомненных преимуществ, которые ранее были просто невозможны при использовании нативных аналогов: усиление биологической активности, удлинение периода "эффективной" полужизни, замедление выведения, понижение токсичности и иммуногенности. К основным недостаткам ПЭГ - коньюгированных пептидов, используемых и в качестве уже разрешенных лекарственных форм, и в продолжающихся клинических испытаниях, можно отнести: возможное уменьшение активности белка, связанное с выбором "неправильного" размера или структуры ПЭГ; с этой же причиной может быть связано и возможное удлинение элиминации пептида. Так или иначе, полученные результаты уже проведенных и продолжающихся клинических испытаний с ПЭГ - модифицированными препаратами белковой структуры, а также экспериментальные данные свидетельствуют о явном преимуществе коньюгированных аналогов по сравнению с нативными белками.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, одним из основных направлений исследований в медицинской биотехнологии является создание функциональных или многофункциональных систем, включающих в свой состав биологически активных вещества. При этом, в первую очередь, ставятся задачи направленной доставки лекарств, создания новых противоопухолевых и антиоксидантных соединений. Рассматриваются направления создания магнитноуправляемых частич, обладающих термочувствительностью. Развитие медицинской биотехнологии в перспективе способно привести к новому уровню понимания биологических процессов и созданию принципиально новых средств диагностики, профилактики и лечения многих заболеваний.

РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА

Основная:

А. Ленинджер. Основы биохимии: В трех томах. (1985) Изд-во: М.: Мир. Серия Биотехнология, книга 1 «Проблемы и перспективы». Москва. Высшая школа. 1987. Серия Биотехнология, книга 7 «Иммобилизованные ферменты». Москва. Высшая школа. 1987. Жан-Мари Лен. Супрамолекулярная химия. Концепции и перспективы. Издательство: Наука, Новосибирск. 1998.

Дополнительная:

Дж. В. Стид, Дж. Л. Этвуд. Супрамолекулярная химия (комплект из 2 книг). Академкнига. 2007. Наноматериалы, наноструктуры, нанотехнологии. Физматлит. Москва. 2007 г. Ч. Пул-мл.,Ф. Оуэнс Нанотехнологии. 3-е издание Техносфера. Москва. 2007.  , Ле Банг Шон, , . (1999) Липосомы и другие наночастицы как средство доставки лекарственных веществ. Вопросы медицинской химии. Том 45 (1). , . (2001) Пегилированные лекарственные преапраты: современное состояние проблемы и перспективы (www.hepatit.ru). Nanotoday 2008. vol. 3 (3-4) p. 12-21 and 22-30. Niemeyer C., Mirkin C., Nanobiotechnology: Concepts, Applications and Perspectives. Wiley, 2004. Goodsell D., Bionanotechnology: Lessons from Nature. Wiley-Liss, 2004. Reddy R. - Controlled - release, pegylated, liposomal formulations: new mechanisms in the delivery of injectable drugs. - Ann. Pharmacol. - 2000; М. 34. 915 – 923.

ЗАДАЧА 4

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗАДАЧА

ИЗУЧЕНИЕ ТЕРМОСТАБИЛЬНОСТИ ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА ЩЕЛОЧНОЙ ПРОТЕАЗЫ. СТАБИЛИЗАЦИЯ ЩЕЛОЧНОЙ ПРОТЕАЗЫ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В СИНТЕТИЧЕСКИХ МОЮЩИХ СРЕДСТВАХ.

А) при комплексообразовании с хитозаном;

Б) при инкапсулировании в системе альгинат-хитозан.

В настоящее время наблюдается значительный интерес к использованию ферментов класса гидролаз в синтетических моющих средствах (СМС). В первую очередь здесь речь идет о протеазах, целлюлазах, амилазах и липазах. Использование этих ферментов в моющих средствах позволяет эффективнее производить удаление загрязнений различной природы и повышает моющую активность традиционных моющих средств на 35-40%. Требования к ферментам при их использовании в качестве добавок к СМС определяются их активностью и стабильностью в присутствии других присутствующих в моющих средствах компонентов (окисляющих агентов, поверхностно-активных веществ), при повышенных температурах и щелочных значениях pH, оптимальных для процессов связанных с удалением загрязнений. Однако, недостаточная стабильность ферментов в условиях оптимальных для проведения удаления загрязнения является проблемой и ограничивает область применения фермент-содержащих СМС.

В данной практической задаче студентам предлагается: для стабилизации щелочной протеазы (одного из основных ферментов, применяемых в СМС) в условиях, моделирующих процесс стирки, применить метод (А) включения фермента в частицы, образованные на основе фермент-полиэлектролитного с природным полисахаридом, хитозаном или (Б) инкапсулирования фермента в системе альгинат-хитозан.