Спецпрактикум кафедры химической энзимологии Задача 4. Применение иммобилизованных ферментных препаратов в биотехнологии и медицине (стр. 5 )

Как носители лекарств липосомы наиболее широкое применение получили в экспериментальной онкологии. Суть в том, что существует ряд препаратов, весьма эффективно разрушающих злокачественные клетки или тормозящих их рост. Однако применить их в терапевтических целях не всегда возможно из-за их большой токсичности или плохой растворимости в воде. С помощью липосом эти трудности могут быть преодолены. Так, одно из свойств липосом, регулируемость их размеров в нанодиапазоне стало основой для конструирования эффективных антираковых препаратов. Речь идет о соотношении размеров частиц и диаметра пор капилляров. В случае когда размер липосом больше диаметра пор капилляров, их объем распределения ограничивается компартаментом введения. Например, при внутривенном введении они не выходят за пределы кровотока, т. е. должны плохо проникать в органы и ткани. Следовательно, резко понижается токсическое действие субстанции, включенной в липосому. С другой стороны, это свойство может служить основой для направленной доставки терапевтических препаратов в опухоли и очаги воспаления, так как капилляры, снабжающие эти области кровью, как правило, сильно перфорированы (рис. 13). Следовательно, частицы, содержащие лекарство будут накапливаться в опухоли. Это явление получило название пассивное нацеливание. Таким образом, существует две причины, вследствие которых липосомальные препараты антиканцерогенных субстанций очень эффективны: уменьшение токсичности и пассивное нацеливание.

Следствия:
- Уменьшение токсичности - Уменьшение объема распределения и, след. - Увеличения концентрации в кровотоке	- Пассивное нацеливание в "горячие" области

Рис. 13. Пассивное нацеливание

Использование липосом для точной, целенаправленной доставки лекарственных веществ имеет, однако, и определенные сложности. Дело в том, что после попадания в организм большая часть липосом поглощается клетками ретикулоэндотелиальной системы (РЭС). Для увеличение времени циркуляции липосомальных препаратов было предложено их поверхность модифицировать полимерами с гибкой гидрофильной цепью, например полиэтиленгликолем (ПЭГ). Для этого используются модифицированные липиды, например, фосфатидилэтаноламин (ФЭ), конъюгированный с ПЭГ. На рис. 14 представлена схема такой "стерически стабилизированной" липосомы. Гибкие молекулы ПЭГ создают в примембранной области избыточное осмотическое давление. Липосомы как бы становятся невидимыми для РЭС (отсюда и название "stealth liposomes").

Рисунок 14. А. Стерически стабилизированные липосомы (Stealth liposomes). Белки (1) не могут достичь поверхности липосом (2) из-за избыточного осмотического давления в примембранном пространстве, создаваемом гибкими цепями (3) иммобилизованных полимеров (например, ПЭГ). Б. Фосфатидилэтаноламин, конъюгированный с ПЭГ, используемый для получения стерически стабилизированных липосом.

Рис. 15. демонстрирует насколько увеличивается время циркуляции стерически стабилизированных липосом.

Рисунок 15. Время циркуляции липосом, модифицированных ПЭГ в сравнении с обычными липосомами (из работы Torchilin V. P. et al. (1994) BВА, 1195, 181-184).

Во многих случаях важна адресная доставка в нужный тип клеток. В качестве "молекулярного адреса" наиболее часто выбирают иммуноглобулины, имеющие соответствующие мишени на целевых клетках.

Таким образом, можно представить модель "идеальной" липосомы, как средства направленной доставки лекарственного вещества в клетку (рис. 17). Такая липосома содержит во внутреннем объеме лекарственное вещество, например, ДНК в случае генной терапии, на ее поверхности иммобилизованы гибкие цепи полимера для уменьшения поглощения клетками РЭС, молекулярный адрес, в мембрану инкорпорированы белки слияния. Кроме того, мембрана состоит не только из обычных фосфолипидов, образующих бислой (чаще фосфатидилхолина), но и липидов способствующих слиянию с мембраной клетки (например, диолеоилфосфатидилэтаноламина).

Рисунок 17. "Идеальная" конструкция липосомы для направленной доставки лекарственного вещества в клетку (из работы , Ле Банг Шон, , . Вопросы медицинской химии. 1999. Том 45. выпуск 1).

1) Полимер для стерической защиты от РЭС (например, ПЭГ); 2) "Молекулярный адрес" на полимерной ножке (в основном иммуноглобулины); 3) Белки слияния (например, гемагглютинин); 4) Лекарственное вещество (например, ДНК); 5) Липидные положительно заряженные частицы для компактизации ДНК; 6) Мембранообразующие липиды (фосфатидилхолин); 7) Липиды, дестабилизирующие мембрану (например, ФЭ).

Основной недостаток липосом как лекарственной формы - относительная небольшая стабильность при хранении. Но, и эта проблема решается. Так, был найден способ сушки предварительно замороженных липосом. Такие высушенные липосомы, содержащие лекарственные вещества, способны храниться достаточно долго: месяцы и годы. Для их использования достаточно прилить к ним тот объем воды, который был удален при сушке.

Обращенные мицеллы - сферические частицы, образованные ассоциатами дифильных молекул ПАВ, в которых гидрофобные части молекул ПАВ направлены в сторону неполярного растворителя, а полярные группы – внутрь мицелл. Обращенные мицеллы самопроизвольно образуются в тройных системах ПАВ-вода-органический растворитель. В качестве мицеллообразующего материала используются разнообразные синтетические ПАВ, а также природные липиды. Мицеллы, построенные из анионных ПАВ, (в отличие от катионных), как правило, характеризуются узким распределением по размерам, размер мицелл не зависит от концентрации ПАВ. Благодаря способности образовывать монодисперсные системы, широкое применение нашли обращенные мицеллы на основе АОТ, натриевой соли ди-(2-этил)-гексилового эфира сульфоянтарной кислоты.

       Ферменты могут включаться в обращенные мицеллы ПАВ в органических растворителях с сохранением их функциональной активности. При солюбилизации ферментов в системе обращенных мицеллы ПАВ молекула белка может «выбрать» оптимальное микроокружение, соответствующее ее природе. Как показано на рисунке 18, молекула гидрофильного белка избегает прямого контакта как с органическим растворителем, так и с поверхностью внутренней полости мицеллы, локализуясь в водном ядре гидратированной обращенной мицеллы. Поверхностно-активные белки, например липазы, имеют возможность взаимодействовать с поверхностным слоем обращенной мицеллы или даже частично в него погружаться. И наконец, типичные мембранные ферменты, если это термодинамически выгодно, могут вступать в контакты с органическим растворителем (рис. 18).

Рис 18. Схематическое изображение обращенной мицеллы, содержащей: гидрофильный (Е1), поверностно-активный (Е2) и гидрофобный (Е3) белок.

Одним из главных достоинств мицеллярных систем является возможность целенаправленного варьирования основных физико-химических параметров путем простого изменения соотношения компонентов системы (рис. 19.).

Рис. 19. Основные способы регуляции параметров системы обращенных мицелл. 1 - увеличение содержания воды при [ПАВ]=const: размеры мицелл растут, их число уменьшается; 2 – увеличение в одинаковой пропорции концентрации воды и [ПАВ]: размеры мицелл остаются неизменными, их число увеличивается; 3 – увеличение концентрации ПАВ при постоянной концентрации воды: размер мицелл уменьшается, их число растет.

Мицеллярный подход является в настоящее время классическим методом контроля олигомерного состава ферментов. Применение обращенных мицелл позволяет целенаправленным подбором размера мицеллярной матрицы (при варьировании степени гидратации системы) формировать желаемую надмолекулярную форму белка. Обращенные мицеллы можно рассматривать как своеобразный «наноконтейнер», позволяющий проводить как ассоциацию, так и диссоциацию белковых комплексов, получать надмолекулярные белковые структуры не реализующиеся в водных растворах. С точки зрения практического применения перспективным направлением является управляемая диссоциация «тел включения» и сворачивание ферментов в системе обращенных мицелл ПАВ. Проблема сворачивания рекомбинантных белков на сегодняшний день остается нерешенной для многих случаев. Особенно, эта проблема проявляется в случае больших, мульти-доменных и гидрофобных ферментов. Особенностью мицеллярного подхода является возможность изолировать молекулу фермента в отдельной мицелле, что с одной стороны, усиливает эффективность процесса сворачивания (подобно действию молекулярных шаперонов), а с другой стороны, защищает фермент от межмолекулярного взаимодействия, образования межмолекулярных S-S-связей и агрегации белка в процессе рефолдинга.

Образование конъюгатов биологически активных молекул с молекулями полиэтиленгликоля (ПЭГ). Применяется для стабилизации белок-содержащих лекарственных средств, увеличения времени циркуляции лекарств, транспорт лекарств, уменьшение иммунного ответа на введение чужеродных белков.

Лекарственные препараты белковой или пептидной структуры (интерфероны, гормоны, факторы роста, цитокины, тромболитики) все больше применяются в медицине. Как уже отмечалось, лечение нативными препаратами белковой природы имеет ряд существенных недостатков: белки быстро гидролизуются в гастроинтестинальном отделе пищеварительного тракта и поэтому используются, как правило, парентерально. Относительно короткий период "естественной" полужизни таких препаратов в организме пациента предусматривает их многократное использование для достижения требуемого терапевтического воздействия. Еще одним важным негативным фактором, ограничивающим применение нативных или рекомбинантных белковых препаратов, является их высокая иммуногенность и связанные с ней сенситивные реакции.