Активность пищеварительной среды почвенных многоножек по отношению к дрожжеподобным грибам (стр. 1 )

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ

УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ

«МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

имени М. В. ЛОМОНОСОВА»

ФАКУЛЬТЕТ ПОЧВОВЕДЕНИЯ

НАПРАВЛЕНИЕ ПОДГОТОВКИ 06.03.02  «Почвоведение»

КАФЕДРА БИОЛОГИИ ПОЧВ

БАКАЛАВРСКАЯ РАБОТА

«АКТИВНОСТЬ ПИЩЕВАРИТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ПОЧВЕННЫХ МНОГОНОЖЕК ПО ОТНОШЕНЮ К ДРОЖЖЕПОДОБНЫМ ГРИБАМ

Выполнила студентка

Научный руководитель:

Д. б.н., в. н. с.

к. б.н., м. н.с.

Рецензент:

Д. б.н., заведующий лабораторией

почвенной зоологии и общей энтомологии ИПЭЭ РАН

Допущена к защите 18.05.2017

Зав. Кафедрой 

Москва

2017

Содержание

Обозначения и сокращения………………………………………………………3

Введение        .4

I. Обзор литературы        66

II. Экспериментальная часть        9

1. Объекты исследования        9

2. Методы исследования.        10

3. Методика исследований        15

4. Результаты и обсуждения        17

Заключение        31

Список используемой литературы        32

Приложения……………………………………………………………………  35

Обозначения и сокращения

ГПД-глюкозо-пептонно дрожжевая (среда)

ЗО-задний отдел

КЖ - кишечная жидкость

ПМР - протонный магнитный резонанс

СО-средний отдел

ЯМР - ядерно-магнитный резонанс

Введение

Существуют исследования, в которых показано, что беспозвоночные – регуляторы микробной активности в почвенных экосистемах. (Бызов, 2005; Тхань, 1993). Один из малоизученных механизмов этой регуляции - взаимодействие микроорганизмов с пищеварительной средой животных.

Многоножки как деструкторы растительного опада потребляют вместе с ним большое количество разнообразных бактерий и грибов. В пищеварительном тракте происходит специфичное взаимодействие потребленных микроорганизмов и кишечной жидкости, в результате которого некоторые популяции гибнут, некоторые продолжают расти и развиваться. Таким образом в экскрементах, а затем и в почве изменяется видовой состав микробного сообщества.

Очевидно, что вещества, влияющие на жизнедеятельность микроорганизмов, могут быть использованы в совершенно различных прикладных областях: от биотехнологии до медицины.

На примере представителей отряда Julida изучалась регуляция многоклеточным организмом популяций микроорганизмов. В качестве модели микроорганизма были выбраны дрожжевые грибы, так как они легки в опознавании и количественном учете.

Целью настоящей работы является характеристика биологической активности пищеварительной среды почвенных многоножек по действию на рост дрожжевых грибов.

В задачи исследования входило:

Описание реакции дрожжевых грибов как модельного объекта в пищеварительной среде многоножек из отряда кивсяков, собранных в Москве и на Южном берегу Крыма. Изучение влияния концентрации суспензии дрожжей при взаимодействии с кишечной жидкостью. Исследование разницы в реакции видов дрожжевых грибов на воздействие кишечных жидкостей. Химический анализ кишечных жидкостей с помощью лаборатории химического факультета МГУ

Предметом исследования было взаимодействие штаммов дрожжей и жидкости среднего и заднего отделов многоножек.

В работе использовались: классические методы микробиологии-посевы, выделение чистых культур и т. д.; измерение оптической плотности суспензии дрожжей; ЯМР для предварительной сравнительной характеристики биологически активных фракций пищеварительных жидкостей многоножек (при участии специалистов).

Хочется выразить благодарность Максимовой Ирине Аркадьевне за предоставление чистых культур и помощь в идентификации штаммов и Сигееву Александру Сергеевичу за консультации и проведение ЯМР-спектроскопии.

Обзор литературы

Взаимодействие  беспозвоночных и  микроорганизмов

Учёные разных стран мира осознавали важность влияния беспозвоночных в почве на микроорганизмы. В первоначальных исследованиях влияние беспозвоночных животных на почвенные микроорганизмы связывали с их воздействием на окружающую среду обитания микроорганизмов. (Козловская, 1976).

Хэнлон (Hanlon, 1981), по всей видимости, впервые применил прямые микроскопические методы для измерения конечного урожая грибов и бактерий на экскрементах мокриц и на исходном опаде. Было показано, что пропускание опада через кишечник беспозвоночных животных оказывает существенное влияние на соотношение грибов и бактерий в опаде, при этом биомасса грибов уменьшается, а биомасса бактерий резко возрастает.

В серии работ (Dash et al., 1979, 1986) показана строгая предпочитаемость дождевыми червями определенных видов микромицетов. Проанализировав почву, содержимое кишечника и копролиты ряда тропических червей он условно разделил грибы на «переваривающиеся» Actinomucor spp., Nigrospora sphaeria., Rhizopus nigricans,; и на «не переваривающиеся» Aspergillus niger, Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Penicillium spp.. По данным микроскопии снижение биомассы грибного мицелия в процессе однократного пассажа через кишечник дождевых червей составило 35-79%, размер фрагментов гиф уменьшался по мере продвижения к заднему отделу кишечника.

На аттракцию дождевых червей указывает ряд авторов. Список аттрактантов и видов репеллентов близок к приведенному выше (Piearce, 1978, Cooke, 1983).

Домш и Бейнс (Domsh, Banse, 1972) показали, что при высеве экскрементов дождевых червей наблюдается некоторое уменьшение обилия грибов Trichoderma и мукоровых. Однако, с какими факторами могут быть связаны эти изменения в этих исследованиях не изучалось.

В исследованиях Стебаева (1984) было установлено, что уже в передних отделах кишечных трактов беспозвоночных происходит бурное развитие в первую очередь обычных почвенных микроорганизмов, совместно со специфическими кишечными. У сапрофагов своеобразие микрофлоры, обнаруживаемой в кишечнике, состояло в уменьшении количества грибов и увеличении числа бактерий по сравнению с почвой.

Для крупных беспозвоночных, таких, как дождевые черви, кивсяки, мокрицы, считается, что основными пищевыми объектами являются отмершие растительные остатки, вместе с которыми к ним в кишечник и попадают микроорганизмы, которые частично может быть потреблены животными (Gunnarson, 1987; Bignell, 1989).

Показано, что у коллембол существуют достоверные пищевые предпочтения по отношению к дрожжам. (Менько и др., 2006).

Предполагается, что одним их механизмов переваривания пищи, в частности и у почвенных беспозвоночных, является индуцированный автолиз (Уголёв, 1991). В пищеварительной среде животных происходит высвобождение из клеточных вакуолей (в первую очередь лизосом) в цитоплазму собственных гидролитических ферментов поглощенного микроогранизма и запускается процесс самопереваривания. При этом, в клетках могут быть структуры, лишенные лизосом, и хищнику необходимы вещества для переваривания этих структур.

Для запуска всего процесса необходимы особые условия среды: необходимо разрушить лизосомы жертвы и обеспечить оптимальные условия для работы высвободившихся ферментов, и ферментов хозяина. Однако, микроорганизмы иногда способны пережить и такие условия.

Исследование киллерных свойств пищеварительной жидкости велось для многих организмов: Хомяковым с соавтрорами (2007) был впервые обнаружен эффект быстрой гибели микроорганизмов в пищеварительной жидкости дождевых червей, обнаружена специфичность действия жидкости на микроорганизмы и впервые исследованы киллерные вещества в пищеварительной жидкости дождевых червей. В ходе этих исследований, было доказано, что киллерный агент является низкомолекулярным органическим веществом небелковой природы.

Исследования кишечной жидкости диплопод показали, что при прохождении дрожжей через пищеварительную систему дрожжи перевариваются, причем в два этапа: сначала быстро гибнут клетки за счет термостабильного неферментативного фактора, вызывающего нарушения мембранных структур клетки, и далее клетки лизируются ферментами животного. Описанный механизм селективен по отношению к дрожжам разных мест обитания. Наиболее чувствительны штаммы дрожжей, выделенные не из кишечника беспозвоночных. С помощью метода меченных атомов показано, что более 80% биомассы дрожжей при прохождении через кишечник погибает. (Тхань, 1993).

В заключение обзора можно привести цитату из книги «Зоомикробные взаимодействия» (Бызов, 2005).

«Беспозвоночные осуществляют отбор микробных популяций и модифицируют микробные сообщества, пассируя пищевые субстраты через свой пищеварительный тракт. Переваривание микроорганизмов основано на «киллерном» эффекте; оно – видо - и даже штаммоспецифично. Киллерный механизм – фактор, определяющий разнообразие трофических связей в почвах. В ряде систем роль макрофауны в регуляции продукционного процесса микроорганизмов существенна.»

II. Экспериментальная часть

1. Объекты исследования

1.1 Беспозвоночные животные

Cylindroiulus caeruleocinctus

Для исследований было произведено несколько отборов (апрель-май и октябрь 2015, октябрь 2016) двупарноногих многоножек Cylindroiulus caeruleocinctus, обитающих в окрестностях почвенного стационара на Ленинских Горах, г. Москва. Древесный ярус представлен березой и клёном.

Pachyiulus flavipes

Кивсяки, отобранные на южном берегу Крымского полуострова, в садах г. Гурзуфа в ноябре 2014, мае 2015, 2016 годов. Древесный ярус представлен дубом и грабинником.

1.2 Дрожжевые грибы

Не идентифицированные виды дрожжей:

Выделенные из среднего отдела кивсяка Pachyiulus flavipes: Рсо-4 и Рсо-6 Выделенные из заднего отдела кивсяка Pachyiulus flavipes:

Pf-1c-3, Pf-1c-5, Pf-1c-6, Pf-1c-7, Pf-1c-8

Выделен из подстилки с кивсяками Pachyiulus flavipes:  Под-9

Идентифицированные виды дрожжей:

Kwoniella pini – из почвы г. Апатиты, Мурманская область Curvibasidium pallidicorallinum  – с поверхности цветов, Никитский ботанический сад, Крым Candida anglica – из мякоти плодов инжира, Никитский ботанический сад, Крым Metschnikowia reukaufii – с поверхности цветов клевера, Никитский ботанический сад, Крым Candida sake – из почвы альпийского луга, Аламудунский район, Тянь-Шань Cystofilobasidium capitatum  – из почвы национального парка «Русский север», Вологодская область Kluyveromyces marxianus  –  с поверхности цветов коровяка, Крым Saccharomyces cerevisiae – промышленный штамм, пакетированные дрожжи для выпечки

Штаммы дрожжей, использованные в работе, и их местообитания также представлены в таблице (см. таблицу 1)