Изучение биологических эффектов соединений цинка и свинца на биолюминесцентные бактериальные штаммы Черного и Азовского морей (стр. 3 )

2.  МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы исследования

Объекты исследования

Штаммы биолюминесцентных бактерий, выделенные из бассейнов Черного и Азовского морей и индетифицированные как Allivibrio fischeri F1, Photobacterium leognathi Sh1, Vibrio harveyi Ms3, их кодировки: Рб1, Криль1, Мид3 соответственно [24]. Штаммы предоставлены кафедрой Медицинской и фармацевтической химии Медицинской Академии имени , ФГАОУ ВО «КФУ имени ».

Выбранные бактериальные штаммы относятся к семейству Vibrionaceae, к родам Allivibrio, Vibrio и Photobacterium. Обитают в теплых водах с температурой выше +15єС [25].

Allivibrio fischeri – грамотрицательные подвижные палочки с пучком жгутиков, содержат желтый пигмент. Различные штаммы различаются по образованию кислоты из сахаров и салицила, некоторые штаммы гидролизуют крахмал. Встречаются как свободноживущие формы, так и симбионты. Обладают уникальной способностью генерировать «желтое свечение» обладают. Содержат 38-51мол. % ГЦ-пар в ДНК.

Vibrio harveyi – грамотрицательные правильные слегка изогнутые палочки размером 0,5‒0,8Ч1,4‒2,6 мкм, способны к образованию желтого пигмента, не способны накапливать поли-в-оксибутират, имеют полярный жгутик в чехле. Некоторые штаммы на агаризованной среде образуют дополнительные жгутики. Не способны к образованию капс-51мол. % ГЦ-пар в ДНК. Особенностями является формирование уникальных симбиотических ассоциаций с кальмарами, а также результаты секвенирования двух ферментов – глутаминсинтетазы и супероксддисмутазы.

Photobacterium leognathi – грамотрицательные подвижные короткие палочки с 1-3 полярными неочехленными жгутиками, факультативные анаэробы, хемоорганотрофы, сбраживают глюкозу и другие углеводы с образованием кислот без выделения газа. Оптимальная температура роста и люминесценции 20є ‒ 30єС. Содержат 46‒48 мол. % ГЦ-пар в ДНК. Накапливают поли-в-гидрокси-бутират. Имеют специфическую потребность в ионах Na и часто встречаются как симбионты в световых органах [7; 22].

Предмет исследования

Биологические эффекты дигидрата ацетата цинка(Zn(CH3COO)2⋅2H2O), гептагидрата сульфата цинка(ZnSO4⋅7H2O), оксида цинка(ZnO) и тригидрата ацетата свинца(Pb(CH3COO)2⋅3H2O) (ч. д. а. - чистые для анализа) на избранные штаммы биолюминесцентных бактерий.

Методология Методика приготовления питательных сред для бактерий

Питательный агар

Состав  Ингредиенты грамм/литр

Пептидный гидролизат животной ткани  5.000

Хлорид натрия  +5,000

Экстракт говядины  1.500

Дрожжевой экстракт  1.500

Агар  15,000

Конечное значение рН (при 25 ° С)  7,4 ± 0,2

Питательный бульон

Состав  Ингредиенты грамм/литр

Пептидный гидролизат животной ткани  5.000

Хлорид натрия  +5,000

Экстракт говядины  1.500

Дрожжевой экстракт  1.500

Конечное значение рН (при 25 ° С)  7,4 ± 0,2

Состав выверен и доведен до соответствия необходимыми параметрами.

Приготовление питательных сред

Суспендировать 13 г порошка в 1000 мл дистиллированной воды. Нагреть, если это необходимо, чтобы полностью растворить среду. Разлить в чашки Петри и стерилизовать автоклавированием при давлении 15 атм. (121 ° С) в течение 15 минут.

Принцип и описание питательных сред

Питательные среды являются основными средами, используемыми для поддержания микроорганизмов [26; 27]. Питательный агар и бульон используются для более длительного выживания культур при температуре окружающей среды без риска избыточного роста, что может произойти с более питательным субстратом. Эти среды хорошо сохраняются и до сих пор широко используются для микробиологических исследований, а также рекомендуются стандартной методикой. Это одни из нескольких неселективных сред, пригодные для рутинного культивирования микроорганизмов [28; 29].

Пептидный гидролизат животной ткани, мясной экстракт и дрожжевой экстракт обеспечивают необходимые соединения азота, углерода, витамины и также некоторые следовые компоненты, необходимые для роста бактерий. Хлорид натрия поддерживает осмотическое равновесие среды.

2.2.2. Методика приготовления образцов

С помощью аналитических весов второго класса точности PA114C(ohaus), взвешивали по 1 и 10 мг Zn(CH3COO)2⋅2H2O, ZnSO4⋅7H2O, ZnO, Pb(CH3COO)2⋅3H2O, переносили в пробирки типа «Eppendorf Safe-Lock Tubes» и суспендировали 1 мл дистиллированной воды. Использованные концентрации растворов соединений: 0,0012; 0,0025; 0,005;  0,02; 0,01; 0,05; 0,1; 0,2; 0,5 мг/мл.

Методика приготовления бактериальной суспензии

В емкость, содержащую 5 мл 3% раствора натрия хлорида(NaCl) вносили 100-300 мкл 24 часового инокулята клеток так, чтобы концентрация клеток составляла 105кл/мл и интенсивность люминесценции по шкале биохемилюминометра находилась в пределах 90-100 мВ.

Методика острого тестирования

В ячейку биохемилюминометра (lumat 4400, awareness technology Inc. USA) вносили от 850 до 900 мкл 3% раствора NaCl, 50 мкл натрий-фосфатного буфера(ph=7,2), добавляли от 1 до 50 мкл суспендированного раствора Zn(CH3COO)2⋅2H2O, ZnSO4⋅7H2O, ZnOPb(CH3COO)2⋅3H2O, инкубировали систему в течении 5 минут, и добавляли 50 мкл бактериальной суспензии. Через 5, 15, 30 минут измеряли интенсивность биолюминесценции выбранных бактериальных штаммов с помощью прибора биохемилюминометра (БХ-06).

3.  РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Измерения интенсивности биолюминесценции бактериальных штаммов проводились через 5, 15, 30 минут.

После проведения исследований был избран наиболее оптимальный интервал для измерения показателей свечения бактериальных штаммов. Наиболее оптимальным интервалом времени явился интервал 15 минут, так как на данном интервале наиболее четко прослеживалась закономерность интенсивности биолюминесценции бактериальных штаммов от концентраций исследуемых соединений.

Согласно полученным данным были построены графики и таблицы, которые позволяют в полной мере изучить биологическое действие исследуемых соединений на бактериальные штаммы.

Рис. 1

Таб. 1

Математическая зависимость интенсивности биолюминесценции бактериального штамма Allivibrio fischeri F1 от концентраций ZnO, ZnSO4⋅7H2O, Zn(CH3COO)2⋅2H2O

C, мг/мл	0	0,01	0,05	0,1	0,2	0,5
ZnO	100	54,55	22,72	18,18	9,09	0
ZnSO4⋅7H2O	100	0	6,67	0	0	0
Zn(CH3COO)2⋅2H2O	100	33,33	0	0	0	0

В пробах с оксидом цинка при увеличении концентрации от 0,01 до 0,5 мг/мл происходит постепенное снижение интенсивности биолюминесценции бактериальных клеток от 55% до 0% соответственно. Для дигидрата ацетата цинка в пробе с концентрацией 0,01 мг/мл показатель биолюминесценции составил 33%. Для гептагидрата сульфата цинка наблюдаем ингибирование свечения бактерий в пробах с концентрациями 0,01 и от 0,1 до 0,5 мг/мл. Однако в пробе с концентрацией сульфата цинка 0,05 мг/мл происходит повышение показателя интенсивности биолюминесценции до 7%.

Рис. 2

Таб. 2

Математическая зависимость интенсивности биолюминесценции бактериального штамма Vibrio harveyi Ms3 от концентраций ZnO, ZnSO4⋅7H2O, Zn(CH3COO)2⋅2H2O

C, мг/мл	0	0,01	0,05	0,1	0,2	0,5
ZnO	100	40,35	12,76	7,32	7,01	1,75
ZnSO4⋅7H2O	100	98,3	8,48	1,69	0	1,69
Zn(CH3COO)2⋅2H2O	100	12,5	4,17	4,17	2,08	2,08

В пробах с оксидом цинка при увеличении концентрации от 0,01 до 0,5 мг/мл происходит постепенное снижение интенсивности биолюминесценции бактериальных клеток от 40% до 2% соответственно. В пробах с концентрациями гептагидрата сульфата цинка от 0,01 до 0,2 мг/мл так же происходит снижение интенсивности биолюминесценции бактерий от 98% до 0%. Однако в пробе с концентрацией гептагидрата сульфата цинка 0,5 мг/мл показатель интенсивности биолюминесценции бактериального штамма повышается на 2%. В пробах с дигидратом ацетата цинка при увеличении концентрации от 0,01 до 0,5 мг/мл так же происходит постепенное снижение показателя интенсивности биолюминесценции от 12,5% до 2% соответственно.

Рис. 3

Таб. 3

Математическая зависимость  интенсивности биолюминесценции бактериального штамма Photobacterium leognathi Sh1 от концентраций ZnO, ZnSO4⋅7H2O, Zn(CH3COO)2⋅2H2O

C, мг/мл	0	0,01	0,05	0,1	0,2	0,5
ZnO	100	34,29	17,14	14,29	8,57	2,86
ZnSO4⋅7H2O	100	5,71	14,29	2,86	0	0
Zn(CH3COO)2⋅2H2O	100	3,26	2,17	2,17	1,08	1,09

В пробах с оксидом цинка при увеличении концентрации от 0,01 до 0,5 мг/мл происходит постепенное снижение интенсивности биолюминесцентной реакции от 34% до 3% соответственно. В пробах с концентрацией гептагидрата сульфата цинка, равной 0,01 мг/мл, показатель интенсивности биолюминесценции составляет 6%, с концентрацией 0,05 мг/мл он повышается до 14%, в пробе с концентрацией 0,1 мг/мл происходит снижение показателя интенсивности биолюминесценции до 3%. Для дигидрата ацетата цинка, так же как и для оксида цинка, наблюдается постепенное снижение интенсивности биолюминесценции бактериальных клеток от 3% до 1% соответственно.