Изучение биологических эффектов соединений цинка и свинца на биолюминесцентные бактериальные штаммы Черного и Азовского морей (стр. 1 )

Министерство образования и науки Российской Федерации

Министерство образования, науки и молодежи Республики Крым

Секция: «Биология»

Изучение биологических эффектов соединений цинка и свинца на биолюминесцентные бактериальные штаммы Черного и Азовского морей

Работу выполнила:

,

ДЧ МАН,

учащаяся 11- М класса МБОУ «СОШ№2» г. Симферополя

Научный руководитель:

,

учитель биологии и химии, учитель высшей

категории МБОУ «СОШ №2»г. Симферополя

Научные консультанты:

, доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой Медицинской и фармацевтической химии Медицинской Академии им. ,

ФГАОУ ВО «КФУ им. »,

,

ассистент кафедры Медицинской и фармацевтической химии

Медицинской Академии им. ,

ФГАОУ ВО «КФУ им. »

СОДЕРЖАНИЕ

1.        ВВЕДЕНИЕ        3

1.1. Литературный обзор        6

1.1.1. Биолюминесцентные бактерии        6

1.1.2. Влияние тяжелых металлов на микроорганизмы        9

1.1.3. Ингибирование роста культур микроорганизмов тяжелыми металлами        9

1.1.4. Влияние тяжелых металлов на энергетические и биосинтетические процессы        10

1.1.5. Способность микроорганизмов к сорбции и осаждению тяжелых металлов        11

1.1.6. Адсорбционные процессы и внутриклеточное накопление тяжелых металлов микроорганизмами        11

2.  МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ        14

  2.1. Материалы исследования        14

2.2.        Методология        15

2.2.1.        Методика приготовления питательных сред для бактерий        15

2.2.2.  Методика приготовления образцов        16

2.2.3.        Методика приготовления бактериальной суспензии        16

3.  РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ        18

4.        ВЫВОДЫ        36

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ        38

ПРИЛОЖЕНИЯ        41

ВВЕДЕНИЕ

Антропогенному и естественному загрязнению постоянно подвергаются атмосфера, гидросфера и литосфера Земли, поэтому биологический мониторинг окружающей среды является актуальным и его востребованность определяется возрастающим вниманием к проблеме техногенного загрязнения природных экосистем, на рубеже веков ставшей одной из приоритетов современной биологической науки.

Химические поллютанты, в связи со своим выраженным канцерогенным и мутагенным действием, наиболее опасны. Значительную долю химических загрязнителей окружающей среды составляют тяжелые металлы. Однажды попав в биогеохимический цикл, они крайне редко и медленно покидают его. Тяжелые металлы представляют огромную опасность для живых организмов, так как они способны накапливаться в тканях, вызывая ряд заболеваний.

Одним из самых опасных для живых организмов тяжелых металлов является свинец. Свинец воздействует на нервную и сердечно-сосудистую систему человека, способен накапливаться в костях, вызывая их постепенное разрушение, концентрироваться в печени и почках. Основной источник загрязнения окружающей среды свинцом - автотранспорт, использующий свинецсодержащий бензин.

Незаслуженно мало внимания уделяется загрязнениям соединениями цинка, так как цинк и его соединения в реальных условиях так же обладают широким спектром токсического действия с многообразными клиническими проявлениями. Цинк может представлять мутагенную и онкогенную опасность.

Загрязнение соединениями цинка происходит при сбрасывании в окружающую среду фармацевтическими компаниями производственных отходов, так как цинк находит широкое применение в производстве лекарств.  Также загрязнение окружающей среды цинком происходит при неправильной утилизации батареек.

Актуальность работы:

Тяжелые металлы оказывают токсическое действие не только на организм человека, но и на некоторые группы микроорганизмов, что проявляется в ингибировании метаболизма и изменениях кинетики роста и морфологии [1]. В качестве механизмов, обеспечивающих устойчивость микроорганизмов к воздействию тяжелых металлов, отмечают биологическую трансформацию и частичную детоксикацию некоторых из них [2]. Прослеживается зависимость процессов жизнедеятельности бактерий от концентраций цинка и свинца [3].

К экспрессным методам биологического мониторинга окружающей среды относится биолюминесцентный метод. Биолюминесцентная система отличается высокой чувствительностью к микроколичествам загрязняющих веществ, биотесты на основе светящихся бактерий дают интегральную оценку токсичности, часто превосходят другие известные биотесты в скорости, точности, чувствительности и простоте использования [4]. Это доказывает правильность выбора метода использования биолюминесцентных бактерий для анализа загрязненности сред соединениями цинка и свинца.

Новизна работы:

Ранее исследования воздействия выбранных нами концентраций соединений цинка и свинца на штаммы биолюминесцентных бактерий Черного и Азовского морей не проводились. Кроме этого, различные концентрации соединений цинка и свинца в средах будут воздействовать на бактерий по-разному, и, следовательно, возникает необходимость в составлении математических зависимостей интенсивности биолюминесценции от концентраций исследуемых соединений.

В связи с вышеизложенным, целью работы является: изучить биологические эффекты соединений цинка и свинца на биолюминесцентные бактериальные штаммы Allivibrio fischeri F1, Photobacterium leognathi Sh1, Vibrio harveyi Ms3 Черного и Азовского морей.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

Оценить биологические эффекты соединений цинка и свинца на жизнедеятельность штаммов биолюминесцентных бактерий, выделенных из Черного и Азовского морей, предоставленных кафедрой Медицинской и фармацевтической химии Медицинской Академии имени , ФГАОУ ВО «КФУ имени ». Получить графические и математические зависимости интенсивности биолюминесценции избранных бактериальных штаммов от концентраций исследуемых соединений. Определить наиболее оптимальный штамм бактерий для тестирования

  изучаемых веществ.

Объекты исследования: три штамма биолюминесцентных бактерий, выделенные из Черного и Азовского морей, Allivibrio fischeri  F1, Photobacterium leognathi Sh1, Vibrio harveyi Ms3, предоставленные кафедрой Медицинской и фармацевтической химии Медицинской Академии имени , ФГАОУ ВО «КФУ имени ».

Предмет исследования: биологические эффекты дигидрата ацетата цинка(Zn(CH3COO)2⋅2H2O), гептагидрата сульфата цинка(ZnSO4⋅7H2O), оксида цинка(ZnO) и тригидрата ацетата свинца(Pb(CH3COO)2⋅3H2O) (ч. д. а. - чистые для анализа) на избранные штаммы биолюминесцентных бактерий.

Исследования проводились на кафедре медицинской и фармацевтической химии Медицинской Академии им. , ФГАОУ ВО «КФУ имени в период сентябрь – ноябрь 2016.

В работе были использованы биолюминесцентные аналитические технологии. Для выполнения задач были использовали следующие методики:

1. Методика приготовления питательных сред для бактерий.

2. Методика приготовления образцов.

3. Методика приготовления бактериальной суспензии.

4. Методика острого тестирования.

1.1. Литературный обзор

Биолюминесцентные бактерии

Биолюминесценция - генерация видимого света живыми организмами, характерна для самых разнообразных биологических видов, относящихся как к прокариотам, так и к эукариотам: рыб, кальмаров, гидроидных полипов, водорослей и других объектов. 80% светящихся организмов являются обитателями морей и океанов, заселяют морские акватории от полярных до тропических зон, от поверхностных слоев до глубин океанов. В настоящее время установлено тысячи видов, относящихся более чем к тридцати семействам, способные излучать видимый свет.

В основе свечения всех организмов лежит хемилюминесцентный процесс преобразования энергии, в котором участвуют специфические ферменты - люциферазы, органические молекулы люциферины и кислород. В присутствии люцифераз эффективность преобразования химической энергии в световую возрастает на много порядков. Филогенетически люциферазы у различных светящихся организмов существенно различаются. То же самое касается органических субстратов-люциферинов. Центральную роль у морских светящихся организмов отводится целентеразину, который, как и люциферин, участвует в преобразовании энергии у большинства морских светящихся организмов [5; 6].Светящиеся бактерии являются самым маленьким биологическим объектом, способным генерировать видимую глазом люминесценцию, — продукт, катализируемый бактериальной люциферазой реакции. У фотобактерий в качестве люциферинов могут функционировать восстановленный флафинмононуклеотид (ФМНН2), а также люмазин и рибофлафин в качестве вторичных эмиттеров, а также аналоги и изомеры флавинов. Взаимодействие люциферазы с люциферином в присутствии кислорода приводит к формированию синглетного состояния эмиттера. Трудами ученых Дж. Мак-Элроя, Дж. Гастингса, С. Шимамуры,

Ф. Джонсона, С. Стреллера и М. Кормьера, Е. Мейгена и других к настоящему времени определены основные физиолого-биохимические и физико-химические характеристики биолюминесцентного процесса, структурные и энергетические параметры биолюминесцентной системы. Установлена структура бактериальных люцифераз различных видов бактерий, получены кристаллические структуры бактериальных люцифераз, охарактеризованы субстраты и интермидиаты биолюминесцентного процесса. Изучена генетическая организация биолюминесцентной системы бактерий, механизм трансформации химической энергии в световую, регуляция свечения на биохимическом и молекулярно-генетическом уровне. Получен широкий круг lux-маркированных генно-инженерных штаммов многих видов бактерий. Разработаны биолюминесцентные тест-системы с использованием бактериальной люциферазы, природных фотобактерий и генно-инженерных штаммов для применения в детекции широкого спектра биологически активных веществ и экотоксикантов [7; 8; 9; 10; 11; 12]. Предложены разнообразные схемы преобразования энергии бактериальной люциферазы [13; 14; 15; 16; 17; 18; 19; 20]. Широкий круг исследований направлен на решение практических вопросов применения бактериальной люциферазы и светящихся бактерий для аналитических целей в различных задачах клинической медицины, ветеринарии, охране окружающей среды, фармакологии и других областях. Исследования последних лет направлены на решение молекулярно-генетических и биотехнологических задач. Светящиеся бактерии широко использованы для выяснения механизмов клонирования генов и получения новых рекомбинантных штаммов [21]. Основную привлекательность светящимся бактериям в области молекулярно-генетических исследований создает простота контроля за тем или иным процессом – по эмиссионным параметрам люциферазной реакции. К фундаментальным достижениям научных исследований в области бактериальной биолюминесценции могут быть отнесены следующие: установлены субстраты бактериальной люцифиразы и стехиометрия люциферазной реакции; идентифицировано б, в - субъединичное строение люциферазы; показана функциональная роль длинноцепочечных алифатических альдегидов (С8-С16) в биолюминесцентном процессе; проанализированы кинетические стадии и числа оборотов разных люцифераз; определены физические характеристики квантового выхода эмиссионного процесса; показано образование 4-б-гидроперикиси на первичных стадиях преобразования энергии и флавин-4-б-гидроксида на конечной стадии процесса. Установлено, что бактериальная люцифераза функционально является монооксигеназой. Исследованы пути биосинтеза алифатических альдегидов клетки и систем восстановления флавинового субстрата люциферазы (редуктаза жирных кислот и НАДН:ФМН-оксидоредуктаза).