Биохимия практикум Темы занятий (стр. 2 )

____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Рекомендуемая литература

Основная

Кухта, В. К и др. Биологическая химия: учебник / , , ; под ред. . – Минск: Асар, М.: Издательство БИНОМ, 2008. – С. 3-4, 7-40. Биохимия: Учебник для вузов / Под ред. . – 4-е изд., испр. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2006. – С. 9-69. Филиппович, биохимии. – 4-е изд. – М.: Агар, 1999. – С. 5-14, 23-78. Николаев, химия. М.: Медицинское информационное агентство, 2004. – С. 24-60. Марри, Р. и др. Биохимия человека: в 2-х т.: Пер. с англ., М.: Мир, 2004. – Т.1: С. 16-19, 42-51. Березов, химия / , . – М.: Медицина, 1998. – С. 19-77.

Дополнительная

Ленинджер, биохимии. М.: Мир, 1985. Т. 1. С. 107–225. , Биоорганическая химия. М.: Медицина, 1991. С. 313–376. и др. Молекулярная биология клетки, М.: Мир, 1994. Т. 1. С. 113–171. Энзимология и биологическое окисление

Занятие 3

Ферменты-1. Строение и функции белков.
Строение, свойства, номенклатура и классификация ферментов.

Цель занятия: закрепить знания по структуре белков, сформировать представления о строении и свойствах, номенклатуре и классификации ферментов. Научиться выполнять качественные реакции на аминокислоты и пептиды.

Исходный уровень знаний и навыков

Студент должен знать:

Характеристику уровней структурной организации белковой молекулы (первичная, вторичная, третичная, четвертичная структуры). Незаменимые микроэлементы. Витамины B1, B2, B3, B6, PP. Строение коферментов NAD+, NADP+. Понятия: коагуляция, порог коагуляции, коллоидная защита Принципы и методы измерения скорости химических реакций.

Студент должен уметь:

Проводить качественные реакции на белки и пептиды.

Структура занятия

Теоретическая часть Понятие о ферментах. История энзимологии. Особенности ферментативного катализа. Строение ферментов. Доказательства белковой природы ферментов. Характеристика уровней структурной организации белковой молекулы (первичная, вторичная, третичная, четвертичная структуры) и связей, удерживающих ее. Высаливание, денатурация, причины, признаки и механизм. Кофакторы ферментов: ионы металлов и коферменты. Участие витаминов в построении коферментов. Роль микроэлементов в ферментативном катализе (Fe, Cu, Co, I, Mg, Zn, Mn, F, Se). Структурно-функциональная организация ферментов: активный (субстратный) центр, каталитический, аллостерический участки. Локализация ферментов в клетке (клеточная мембрана, цитоплазма, митохондрии, ядро, лизосома, рибосомы). Маркерные ферменты. Органно­специфические ферменты. Выделение и очистка ферментов. Качественное обнаружение и количественное определение. Единицы измерения количества и активности ферментов. Номенклатура и классификация ферментов. Практическая часть Решение задач. Лабораторные работы. Проведение контроля конечного уровня знаний.

Задачи

Напишите формулу пептида Глу-Тир-Про-Гис-Сер. Какие из перечисленных цветных реакций будут положительными с данным пептидом:

а) биуретовая, б) Фоля, в) ксантопротеиновая, г) Милона?

О чем свидетельствуют цветные реакции на белки: о наличии белка в биологической жидкости; о первичной структуре белка; о конформации белка; о наличии некоторых аминокислот в структуре белка; о функции белка; о наличии числа уровней структурной организации? Зимогены превращаются в ферменты путем реакций:

а) аденилирования; б) фосфорилирования; в) метилирования; г) ограниченного протеолиза?

Активный центр фермента: содержит каталитические и вспомогательные аминокислоты; создает благоприятное окружение для взаимодействия фермента и субстрата; является основным в формировании свойств третичной структуры фермента; может содержать дополнительные сайты небелкового строения, необходимые для каталитического действия; обязательно содержит SH-группы? Простетическая группа фермента представляет собой:

а) альфа-спираль молекулы фермента; б) апофермент; г) небелковую часть фермента; д) холофермент; е) аллостерический центр фермента?

Функция якорного участка фермента:

а) превращение субстрата; б) связывание субстрата; г) временное связывание регулятора с последующим отщеплением; д) поддержание конформации активного центра?

7. Катал – это единица, отражающая:

а) активность фермента; б) константу Михаэлиса-Ментен; г) концентрацию фермента; д) концентрацию ингибитора; е) коэффициент молекулярного погашения?

8. Активность фермента, выраженная в каталах, имеет размерность:

а) моль/мин; б) моль/с; в) мкмоль/с; г) мкмоль/мин; д) моль/час?

9. Ферменты разделяются на 6 классов в соответствии с:

а) типом катализируемой реакции; б) структурой; в) субстратной специфичностью; г) активностью; д) органной специфичностью?

Лабораторные работы

Лабораторная работа № 1.Цветные реакции на белки и аминокислоты

Биуретовая реакция.

Принцип метода. см. в занятии «Строение и функции белков».

ВНИМАНИЕ! Соблюдать меры безопасности при работе с гидроксидом натрия.

Ход работы. В три пробирки наливают по 5 капель растворов: в 1-ю – яичного белка, во 2-ю – желатина, в 3-ю – миозина. В каждую пробирку добавляют по 5 капель 10 %-го раствора гидроксида натрия и по 1 капле 1 %-го раствора медного купороса. Во всех пробирках наблюдают устойчивое сине-фиолетовое окрашивание.

Выводы по результатам работы.

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Нингидриновая реакция.

Принцип метода. Основан на образовании димера нингидрина и азота аминогруппы сине-фиолетового цвета (комплекс Руэмана ‑ см. уравнение).

Ход работы. К 5 каплям раствора белка прибавить 5 капель раствора нингидрина и прокипятить 1–2 мин. Появляется сине-фиолетовое окрашивание.

Выводы по результатам работы.

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Ксантопротеиновая реакция (Мульдера).

Принцип метода. Основан на образовании нитросоединений ароматических и гетероциклических аминокислот, окрашенных в ярко-желтый цвет (см. уравнение).

ВНИМАНИЕ! Соблюдать меры безопасности при работе с концентрированной азотной кислотой.

Ход работы. В три пробирки наливают по 5 капель растворов: в 1-ю – яичного белка, во 2-ю – желатина, в 3-ю – миозина. В каждую пробирку добавляют по 3 капли концентрированной азотной кислоты и осторожно кипятят. В первой пробирке образуется осадок желтого цвета, а во второй – слабое окрашивание, т. к. желатин не содержит циклических аминокислот. В 3‑й пробирке образуется осадок белого цвета, переходящий в желтый цвет. Пробирки охлаждают и добавляют в каждую по 10–15 капель 20 %-го едкого натра до изменения окраски растворов вследствие образования натриевой соли динитротирозина.

Выводы по результатам работы.

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Реакция на тирозин (Миллона).

Принцип метода. Основан на образовании осадка ртутной соли динитротирозина кроваво-красного цвета (см. уравнение).

ВНИМАНИЕ! Соблюдать меры безопасности при работе с реактивом Миллона (содержит Hg и HNO3).

Ход работы. В три пробирки наливают по 5 капель растворов: в 1-ю – яичного белка, во 2-ю – желатина, в 3-ю – миозина. В каждую пробирку добавляют по 3 капли реактива Миллона (раствор ртути в азотной кислоте) и осторожно нагревают. Отмечают изменение цвета в пробирках, характеризующее наличие в указанных белках тирозина.

Выводы по результатам работы.

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Реакция Фоля (на аминокислоты, содержащие слабосвязанную серу).

Принцип метода. Основан на щелочном гидролизе сульфгидрильных групп SH белка с последующим отщеплении серы в виде сульфида свинца (PbS) черно-бурого цвета (см. уравнение).

ВНИМАНИЕ! Соблюдать меры безопасности при работе с реактивом Фоля (содержит NaOH и Na2PbO2).

Ход работы. В три пробирки наливают по 5 капель растворов: в 1-ю – яичного белка, во 2-ю – желатина, в 3-ю – миозина. В каждую пробирку добавляют по 5 капель реактива Фоля. Затем интенсивно кипятят и дают постоять 1–2 мин. При этом в 1-й и в 3-й пробирках образуется черный или бурый осадок сульфида свинца. Желатин осадка не образует, т. к. в нем нет серосодержащих аминокислот.

Выводы по результатам работы.

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Лабораторная работа № 2. Реакции осаждения белков

Осаждение белков при кипячении.

ВНИМАНИЕ! Соблюдать меры безопасности при работе с нагреванием пробирок.

Ход работы. В 5 пробирок наливают по 5 капель раствора белка. Первую пробирку нагреть до кипения. Жидкость мутнеет, т. к. разрушаются водные оболочки вокруг молекулы белка, и происходит укрупнение его частиц. Мицеллы белка несут заряд и удерживаются во взвешенном состоянии.

Во 2-й пробирке нагреть раствор до кипения и добавить 2 капли 1 %-го раствора уксусной кислоты до слабого подкисления. При отстаивании выпадает осадок белка. Частицы белка теряют заряд и приближаются к изоэлектрическому состоянию.