Биохимия практикум Темы занятий (стр. 3 )

В 3-ю пробирку добавить 5 капель уксусной кислоты для сильнокислой реакции среды. При кипячении жидкости осадка не образуется, поскольку белковые мицеллы перезаряжаются и несут положительный заряд, что повышает их устойчивость.

В 4-ю пробирку налить 5 капель раствора уксусной кислоты, 2 капли насыщенного раствора хлористого натрия и нагреть. Выпадает белый хлопьевидный осадок, т. е. частицы белка теряют заряд.

В 5-ю пробирку добавить 2 капли раствора гидроксида натрия. При кипячении осадок не образуется, т. к. в щелочной среде отрицательный заряд на частицах белка увеличивается.

Выводы по результатам работы.

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Осаждение белков концентрированными минеральными кислотами.

ВНИМАНИЕ! Соблюдать меры безопасности при работе с концентрированными азотной и серной кислотами.

Ход работы. В 2 пробирки наливают по 10 капель концентрированных кислот: азотной и серной. Наклонив пробирки под углом 45 градусов, осторожно по стенке пробирки приливают равный объем раствора белка так, чтобы обе жидкости не смешивались. На границе двух жидкостей образуется осадок в виде небольшого белого кольца. При добавлении избытка азотной кислоты осадок не исчезает, а при добавлении серной кислоты осадок растворяется.

Выводы по результатам работы.

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Осаждение белков органическими растворителями.

Ход работы. В 2 пробирки вносят по 5 капель раствора белка и прибавляют по 15–20 капель этилового спирта и ацетона.

Выводы по результатам работы.

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Осаждение белков органическими кислотами.

ВНИМАНИЕ! Соблюдать меры безопасности при работе с трихлоруксусной кислотой.

Ход работы. В две пробирки наливают по 5 капель раствора белка и добавляют по 2 капли раствора ТХУ (трихлоруксусной кислоты) в одну и 2 капли сульфосалициловой – в другую. Следят за изменением растворов.

Выводы по результатам работы.

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Лабораторная работа № 3. Разделение альбуминов и глобулинов методом высаливания (УИРС)

Принцип метода. Основан на обратимой реакции осаждения белков из растворов с помощью высоких концентраций нейтральных солей (NaCl, NH4Cl, MgSO4 и др.).

Ход работы. К 1 мл неразведенного яичного белка добавляют 1 мл насыщенного раствора сульфата аммония и перемешивают. Получается полунасыщенный раствор сульфата аммония, в котором выпадает осадок яичного глобулина. Через 5 мин осадок отфильтровывают, в фильтрате остается яичный альбумин. Для высаливания альбуминов к фильтрату добавляют порошок сульфата аммония до полного насыщения, т. е. пока новая порция порошка остается нерастворенной. Выпавший осадок альбумина отфильтровывают. С фильтратом проделывают биуретовую реакцию. Отрицательная реакция указывает на отсутствие белка.

Выводы по результатам работы.

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Рекомендуемая литература

Основная

Кухта, В. К и др. Биологическая химия: учебник / , , ; под ред. . – Минск: Асар, М.: Издательство БИНОМ, 2008. – С. 45-46, 54-60. Биохимия: Учебник для вузов / Под ред. . – 4-е изд., испр. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2006. – С. 9-73, 75-80, 83-92. Филиппович, биохимии. – 4-е изд. – М.: Агар, 1999. – С. 49-78, 95-105. Николаев, химия. М.: Медицинское информационное агентство, 2004. – С. 61-63, 68-78. и др. Биохимия человека: в 2-х т.: Пер. с англ., М.: Мир, 2004. – Т.1: С. 47-51, 63-66, 79-81.

Дополнительная

Березов, химия / , . – М.: Медицина, 1998. – С. 114-143. Ленинджер, биохимии. М.: Мир, 1985. Т. 1. С. 226–302. , Биоорганическая химия, М.: Медицина, 1991. С. 313–376. и др. Молекулярная биология клетки. М.: Мир, 1994. Т. 1. С. 113–171.

Занятие 4

Ферменты-2. Механизм действия ферментов

Цель занятия: закрепить знания по структуре ферментов, сформировать представления о механизме действия ферментов. Научиться выполнять качественные реакции на активность некоторых гидролитических ферментов.

Исходный уровень знаний и навыков

Студент должен знать:

Теоретические основы химической кинетики. Строение моносахаридов. Качественные реакции на альдегидные и спиртовые группы. Строение полисахаридов. Свойство и качественные реакции. Механизм образования шиффовых оснований. Строение и механизм катализа коферментами NAD+ и NADP+.

Студент должен уметь:

Проводить качественные реакции на продукты ферментативного гидролиза.

Структура занятия

Теоретическая часть Свойства ферментов (термолабильность, специфичность и др.). Механизм действия ферментов. Этапы взаимодействия фермента и субстрата. ишера, Д. Кошланда и современные взгляды. Теория промежуточных соединений. Основы термодинамики катализа. Энергия активации. Энергетический барьер. Кинетика ферментативных реакций (факторы, влияющие на скорость ферментативных реакций: природа фермента и субстрата, их концентрация, pH, температура, лекарственные препараты и др.). Константа Михаэлиса (Km) – определение, физическое значение. Регуляция активности ферментов. Роль гормонов, цАМФ, активаторов, ингибиторов. Регуляция активности путем химической модификации ферментов (ограниченный протеолиз, фосфорилирование, метилирование и др.). Виды ингибирования. Аллостерическая регуляция. Свойства аллостерических ферментов. Практическая часть Решение задач и проведение контроля конечного уровня знаний. Лабораторные работы.

Задачи

При увеличении концентрации субстрата скорость ферментативной реакции... сначала возрастает, затем падает; не изменяется; сначала возрастает, затем стабилизируется на постоянном уровне; непрерывно возрастает пропорционально концентрации субстрата; сначала убывает, затем возрастает? Температурный оптимум для большинства ферментов находится в диапазоне:

а) от 36 до 38°C; б) от 40 до 44°C; в) от 30 до 34°C; г) от 0 до 8°C?

Энергия активации – это… энергия, необходимая для перевода всех молекул фермента в активированное состояние; энергия, необходимая для перевода всех молекул субстрата в активированное состояние; разница величин энергий субстратов и продуктов реакции; общая энергия системы? Взаимодействие, описываемое выражением «как рука к перчатке»: субстрат + активный центр; ингибитор + активный центр; регулятор + аллостерический центр; якорная площадка + каталитическая площадка? Активность ЛДГ при увеличении температуры с 30 до 40°C:

а) не изменится; б) станет равной нулю; в) уменьшится в 2-4 раза; г) увеличится в 2-4 раза; д) возрастет в 10 раз?

Активность АсАТ при постепенном изменении температуры с 30 до 70°C:

а) сначала увеличится, затем резко снизится; б) не изменится; в) увеличится в среднем в 32 раза; г) немедленно упадет до нуля; д) будет постепенно нарастать?

Константа Михаэлиса – это… молярный коэффициент экстинкции фермента; коэффициент, отражающий зависимость скорости реакции от температуры; концентрация субстрата, при которой достигается максимальная скорость реакции; концентрация субстрата, при которой скорость ферментативной реакции составляет половину максимальной?

8. Величина константы Михаэлиса отражает:

сродство фермента к субстрату; зависимость скорости реакции от концентрации фермента; зависимость скорости реакции от температуры; сродство фермента к ингибитору; эффекты коферментов и ингибиторов?

Лабораторные работы

Лаборатоpная работа № 1. Изучение действия ферментов

Действие липазы.

Липаза входит в состав сока поджелудочной железы. В желудочном соке она содержится в небольшом количестве и действует только на предварительно эмульгированные жиры. В кишечнике желчные кислоты и белки способствуют эмульгированию липидов. Действие липазы можно обнаружить, добавив ее раствор к молоку, предварительно слабо подщелоченному раствором карбоната натрия в присутствии фенолфталеина, дающего бледно-розовую окраску.

Принцип метода. Липаза ускоряет гидролиз нейтрального жира на глицерин и жирные кислоты (см. уравнение), что приводит к снижению pH и исчезновению розовой окраски индикатора – фенолфталеина.

Ход работы. В две пробирки наливают по 10 капель молока. В 1-ю пробирку добавляют 5 капель панкреатина, содержащего липазу, во 2-ю – 5 капель воды. В обе пробирки наливают по 1 капле 0,5 %-го раствора фенолфталеина и по каплям 1 %-го раствора карбоната натрия до появления бледно-розовой окраски при pH 8,0 (нельзя приливать избыток раствора карбоната натрия). Пробирки помещают в термостат при температуре 38 °С на 30 мин. Наблюдают обесцвечивание раствора в пробирке, содержащей липазу.

Выводы по результатам работы.

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Действие уреазы.

Принцип метода. Уреаза катализирует гидролиз мочевины на двуокись углерода и аммиак (см. уравнение), что приводит к увеличению pH, которое регистрируется индикатором – фенолфталеином.

Ход работы. Берут две пробирки. В 1-ю отмеривают 1мл 1 %-го раствора мочевины, а во 2-ю ‑ 1мл 1 %-го раствора тиомочевины. В каждую пробирку добавляют по 2 капли фенолфталеина и по 1 мл раствора уреазы. Содержимое обеих пробирок встряхивают, оставляют на несколько минут при комнатной температуре и наблюдают за появлением розовой окраски в пробирке с мочевиной и отсутствием окраски в пробирке с тиомочевиной. Содержимое 1-й пробирки приобретает розовую окраску вследствие смещения pH раствора в щелочную сторону за счет образования аммиака.