Биохимия практикум Темы занятий (стр. 4 )

Выводы по результатам работы.

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Лаборатоpная работа № 2. Изучение влияния различных факторов на скорость ферментативных реакций (УИРС).

Влияние активаторов и ингибиторов на активность амилазы.

Ход работы.

1 В одну пробирку вносят 10 капель дистиллированной воды, а во 2-ю – 8 капель воды и 2 капли 1 %-го раствора хлорида натрия, в 3-ю – 8 капель воды и 2 капли раствора сульфата меди.

2 В каждую пробирку добавляют по 20 капель разведенной слюны (1 : 10), пробирки перемешивают, добавляют по 5 капель раствора крахмала и оставляют стоять при комнатной температуре 5 мин.

3 Тем временем готовят 3 пробирки с водой (по 1 мл), подкрашенной каплей раствора йода, и добавляют в них по 3 капли содержимого опытных проб. Наблюдают окрашивание в зависимости от степени расщепления крахмала амилазой. В 1-й пробирке появляется фиолетовая или красно-бурая окраска, во 2-й пробирке, где ионы хлора играют роль активатора, появляется желтая окраска, а в 3-й, где ионы меди тормозят действие амилазы, – окраска остается синей. Если описанная картина не наблюдается, то опыт повторяют через 10–15 мин.

Выводы по результатам работы.

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Влияние pH на активность амилазы слюны.

Оптимум pH для действия амилазы слюны можно определить при взаимодействии ее с крахмалом при различных значениях pH среды. О степени расщепления крахмала можно судить по реакции крахмала с йодом в течение времени. При оптимальном значении pH расщепление крахмала произойдет полностью (окраска с йодом отсутствует). По мере удаления от точки pH в кислую или щелочную сторону произойдет лишь частичное расщепление крахмала до стадии декстринов (красно-бурая или фиолетовая окраска) или крахмал вообще расщепляться не будет (синяя окраска).

Ход работы.

1 В 4 пронумерованные пробирки отмеривают отдельными пипетками по 2 мл фосфатного буфера с различным значением pH (6,0; 6;4, 6,8; 7,4).

2 В каждую пробирку добавляют по 1 мл раствора крахмала и по 0,5 мл разбавленной (1 : 10) слюны, которые помещают в термостат на 10 мин при 38 °С.

3 Из каждой пробирки каплю жидкости смешивают с каплей раствора йода на предметном стекле и сравнивают окрашивание в каждой пробирке. Повторяют эту пробу через 1-2 мин до тех пор, пока проба из 5-й пробирки даст с йодом на стекле красно-бурое окрашивание. Через 1-2 мин после этого во все пробирки добавляют по 2-3 капли раствора йода (начинать с 1-й пробирки). Содержимое пробирок хорошо взбалтывают. Сравнивают между собой окрашивание во всех пробирках и делают вывод о степени расщепления крахмала, а, следовательно, об активности фермента при этом значении pH среды.

Выводы по результатам работы.

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Рекомендуемая литература

Основная

Кухта, В. К и др. Биологическая химия: учебник / , , ; под ред. . – Минск: Асар, М.: Издательство БИНОМ, 2008. – С. 57-82. Биохимия: Учебник для вузов / Под ред. . – 4-е изд., испр. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2006. – С. 92-118. Филиппович, биохимии. – 4-е изд. – М.: Агар, 1999. – С. 102-114. Николаев, химия. М.: Медицинское информационное агентство, 2004. – С. 63-66, 80-97. и др. Биохимия человека: в 2-х т.: Пер. с англ., М.: Мир, 2004. – Т.1: С. 67-68, 76-90, 98-110. Березов, химия / , . – М.: Медицина, 1998. – С. 143-156.

Дополнительная

Ленинджер, биохимии. М.: Мир, 1985. Т. 1. С. 226–302. и др. Молекулярная биология клетки. М.: Мир, 1994. Т. 1. С. 113–171.

Занятие 5

Ферменты-3. Медицинская энзимология

Цель занятия: сформировать представления об основных аспектах и проблемах медицинской энзимологии. Научиться определять активность амилазы в моче и оценивать ее диагностическую значимость.

Исходный уровень знаний и навыков

Студент должен знать:

Строение клетки и основных органелл. Понятие о мутациях и механизмах мутагенеза. Основные этапы биосинтеза белка. Принципы и методы измерения скорости химических реакций.

Студент должен уметь:

Выполнять качественные реакции на активность ферментов биологических жидкостей.

Структура занятия

Теоретическая часть Изоферменты, их биологическая роль. Полиферментные комплексы. Понятие о метаболоне. Изменение активности ферментов в онтогенезе. Основные направления клинической энзимологии. Энзимопатии. Определение. Классификация Степень клинических проявлений энзимопатий. Первичные (наследственные) энзимопатии. Причины возникновения. Механизм развития первичных и вторичных метаболических нарушений при энзимопатиях. Вторичные (приобретенные) – токсические и алиментарные энзимопатии. Причины возникновения. Механизм развития метаболических нарушений. Клинические проявления. Энзимодиагностика, принципы и объекты энзимодиагностики (кровь, моча, слюна, ликвор, пот и др.). Характеристика основных ферментов сыворотки крови (клеточные, секреторные и экскреторные). Типы изменения активности ферментов при патологии (гипо-, гипер - и дисферментемия). Задачи энзимодиагностики. Энзимотерапия. Использование ферментов для заместительной терапии. Лечение хирургических, сердечно-сосудистых, онкологических и др. заболеваний. Иммобилизованные ферменты. Липосомы, вирусные векторы, их применение. Использование ферментов в лабораторной практике для определения концентрации субстратов и активности ферментов. Использование ферментов в промышленности и производстве. Практическая часть Решение задач. Лабораторная работа. Проведение контроля конечного уровня знаний.

Задачи

1. Активность какого фермента повышается при болезнях костной ткани:

а) холинэстеразы; б) щелочной фосфатазы; в) амилазы; г) аланинаминотрансферазы (АлАТ); д) лактатдегидрогеназы (ЛДГ); е) кислой фосфатазы?

2. Активность какого фермента изменяется при болезнях печени и отравлении фосфорорганическими веществами:

а) холинэстеразы; б) щелочной фосфатазы; в) амилазы; г) аланинаминотрансферазы (АлАТ); д) лактатдегидрогеназы (ЛДГ); е) кислой фосфатазы?

3. Активность какого фермента повышается при раке предстательной железы:

а) холинэстеразы; б) щелочной фосфатазы; в) амилазы; г) аланинаминотрансферазы (АлАТ); д) лактатдегидрогеназы (ЛДГ); е) кислой фосфатазы?

4. Ингибиторы протеаз (контрикал, трасилол, гордокс) подавляют активность трипсина, калликреина, плазмина, образуя с ними неактивные комплексы. При каком заболевании можно применять эти лекарственные средства?

а) инфаркт миокарда; б) язва желудка; в) острый панкреатит; г) острый аппендицит; д) фенилкетонурия; е) сахарный диабет?

5. Наибольшая активность АлАТ обнаруживается:

а) в миокарде; б) в скелетных мышцах; в) в почках; г) в крови; д) в печени; е) в головном мозге?

6. Молекула ЛДГ состоит из субъединиц типа:

а) М и В; б) М, В и Н; г) В и Н; д) только В; е) Н и М?

7. При инфаркте миокарда повышается преимущественно активность:

а) креатинкиназы; б) холинэстеразы; в) альфа-амилазы; г) щелочной фосфатазы?

Лаборатоpная работа Количественное определение активности амилазы мочи по Вольгемуту

Принцип метода. Определение активности амилазы в биологических жидкостях (моча, сыворотка крови, слюна) основано на определении минимальной активности (количества) фермента, катализирующего в стандартных условиях гидролиз добавленного крахмала. Амилазная активность мочи выражается количеством миллилитров раствора крахмала, которое расщепляется ферментом, содержащимся в 1 мл неразведенной мочи, при температуре 45 єC за 15 мин.

Ход работы. Берут 10 пронумерованных пробирок и приливают в каждую по 1 мл физиологического раствора. Затем в 1-ю пробирку добавляют 1 мл исследуемой мочи. Содержимое этой пробирки перемешивают, несколько раз втягивая и выпуская жидкость из пипетки. Набирают в пипетку 1 мл смеси и переносят во 2-ю пробирку, и процедуру повторяют вплоть до 10-й пробирки. Из 10-й пробирки 1 мл смеси отбрасывают. При этом получается следующее разведение мочи:

№ пробирки	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
Разведение	1:2	1:4	1:8	1:16	1:32	1:64	1:128	1:256	1:512	1:1024
Гидролиз крахмала

В каждую пробирку добавляют по 1 мл физраствора и по 2 мл 0,1 % раствора крахмала. После перемешивания содержимого пробирки термостатируют 15 мин при температуре 45 °С. После инкубации пробирки охлаждают водопроводной водой и ставят в штатив по порядку. Прибавляют в каждую пробирку по 1 капле раствора йода и перемешивают. Отмечают пробирку с наибольшим разведением мочи, при котором произошло полное расщепление крахмала с йодом. Полученные данные заносят в таблицу.

Расчет. Активность амилазы можно рассчитать по формуле , где n – количество светлых пробирок (в которых произошел гидролиз крахмала). Так, если первые 3 пробирки обесцветились, активность амилазы мочи равна единицам.

Клинико-диагностическое значение. В норме активность амилазы мочи равна 16–64 единицам.

Определение активности амилазы мочи и сыворотки крови широко используется в клинической практике для диагностики заболеваний поджелудочной железы. При острых панкреатитах амилазная активность мочи и сыворотки крови увеличивается в десятки раз, особенно в первые сутки заболевания, а затем, при благоприятном исходе, постепенно возвращается к норме. При тотальном панкреонекрозе активность фермента исчезает. При почечной недостаточности амилаза в моче отсутствует. В детском возрасте увеличение активности амилазы наблюдается при эндемическом паротите, что указывает на одновременное поражение поджелудочной железы вирусом паротита.