Иммуноблоттинг C57 Bl / 6 мышц через неделю после вирусной инъекции показал изменения в соответствии с торможением миостатина. Когда биологически активная формой миостатина воздействует на активин рецепторы IIB внутриклеточного сигнального каскада приводит к фосфорилированию Smad 2/3. Фосфорилированные Smad 2/3 перемещаются к ядру для подавления экспрессии миогенных факторов клеточного цикла в клетках-сателлитах. Другие ключевые регуляторы размера мышц были вовлечены в сигнальные пути миостатина, такие как серин / треонин киназа Akt и MAP киназа ERK, JNK и p38. У C57 Bl / 6 мышей с гиперэкспрессией dnMstat было снижение уровня фосфорилированного Smad 2/3, как было замечено в C2C12 клетках инкубированых с анти-миостатиновыми антителами. В нашем исследовании было также отмечено снижение фосфорилирования JNK и увеличение фосфорилирования Akt после острого торможения у C57 Bl / 6 животных. В соответствии с нашими наблюдениями, недавнее исследование гипертрофии миофибрилл обнаружило повышение уровня фосфорилирования Akt после аденовирусной избыточной экспрессии миостатина пропептида. Эти изменения свидетельствуют о росте мышц за счет ингибирования миостатина частично опосредованого Smad 2/3, Akt и JNK сигнальных путей и указывают, что миостатин функционально тормозится dnMstat. Неизменное IGF-I содержание в мышцах поддерживает механизм повышения фосфорилирования Akt, и достигается за счет ингибирования миостатина, а не увеличения IGF-I. Кроме того, увеличение активированного миостатина в обработанной мышце показывает, что в условиях подавления сигнализации миостатина может быть компенсаторная регуляция и / или повышенние локальной активации миостатина, чтобы снизить влияние блокады. Регуляция миостатина может быть опосредована через Smad7 зависимые авто-регуляторные циклы, которые активируются блокадой миостатина, но это не было рассмотрено в данном исследовании. У животных MDX торможение миостатина было очень эффективно при увеличении размера мышц и их силы в краткосрочной перспективе, однако долгосрочный анализ
дал неоднозначные результаты. Предыдущие исследования, которые использовали антитела, направленные против миостатина в инъекциях или при AAV опосредованной избыточной экспрессия ингибитора продемонстрировали увеличение мышечной массы и увеличение силы после 3-4 месяцев торможения миостатина у молодых животных (1-3 месяцев). Наш анализ животных в возрасте четырех месяцев после трех месяцев торможения миостатина согласуется с ранее опубликованными данными. Существующее увеличение массы всех скелетных мышц рассмотрено на примере камбаловидной и EDL. Однако, после 10-11 месяцев экспрессии dnMstat торможение миостатина не приводит к функциональной пользе в диафрагме или EDL. Это означает, что торможения миостатина в качестве монотерапии не будет достаточно для ослабления дистрофических изменений в наиболее сильно пострадавших скелетных мышцах. В группе MDX 11H диафрагма была эквивалентна силе и степени фиброза мышц по сравнению с контролем (рис. 7). Диафрагма в большей степени, чем мышцы конечностей у мышей, демонстрирует ранние дегенеративные изменения, прогрессирующую потерю сократительной функции и десять раз выше содержание коллагена, чем в других скелетных мышцах. Предыдущие долгосрочные исследования по изучению мембран в условиях пониженной сигнализации миостатина сообщали о некоторй гистологической пользе, но не продемонстрировали улучшение функции. В то время как MDX / MSTAT KO диафрагмы демонстрирует улучшение гистопатологии на более поздний момент времени (18 месяцев), чем рассмотрены в данном исследовании, неясно, если ли очевидное гистологическое улучшение, которое коррелирует с повышенной функцией. Таким образом, в то время как долгосрочное ингибирование миостатина улучшает мягкой дистрофией, в лице MDX мышц конечностей, она не достаточно ездить роста мышц и снижение мышечной активности фибробластов для компенсации тяжелой дистрофией, в лице MDX диафрагмы.
Функциональный анализ медленных волокон камбаловидной мышцы и быстро сокращающихся волокон мышцы EDL показали различные эффекты долгосрочного ингибирования миостатина. Камбаловидная мышца содержит типы волокон более сходные с скелетными мышцами человека, и поэтому наблюдаемое увеличение удельной силы в долгосрочной перспективе является обнадеживающей находкой для клинических исследований в будущем. Этот результат можно объяснить сдвигом типов волокна к MHC быстрых изоформ. Однако, не ясно, будут ли скелетные мышцы человека смещаться в том же порядке. В одиннадцать месяцев MDX 11H в EDL снизилась производительная сила. Эти результаты аналогичны блокаде миостатина у мышей, которая демонстрирует уменьшение удельной силы в EDL, но не камбаловидной мышце. Точная этиология пониженной удельной мощности силы в EDL в настоящее время неизвестна. Документированных нарушений EDL при блокаде миостатина, такие как уменьшение числа митохондрий в волокнах, не достаточно, чтобы объяснить падение конкретных производственных сил. Модуляция TGF-? / Smad сигнального пути у мышей и долгосрочное торможение миостатина у MDX мышей приводит к снижению силы EDL, которая имеет сомнительную терапевтическую полезность. Этот эффект по-видимому, сводится к быстрым типам волокон. Дальнейшие эксперименты должны определить механизм нарушения силы в зависимости от типа волокна в связи с блокадой миостатина. Отсутствие гипертрофии волокон типа I в ответ на торможение миостатина у мышей прогнозирует, что в организме человека лечение, которое блокирует миостатин, независимо от модальности, будет гораздо менее эффективным, чем в доклинических исследованиях у мышей. По сравнению с грызунами в скелетных мышцах человека имеется гораздо меньше быстрых волокон. Например, человеческая камбаловидная мышца полностью состоит из волокон типа I, когда мышиная камбаловидная мышца состоит приблизительно из 60% волокон IIA и 40% I волокна. Важно отметить, что человеческие скелетные мышцы не содержит волокон типа IIB. Тип IIB волокон содержит высокую плотность активин рецепторов IIB, эндогенной активности промотора миостатина и экспрессии миостатина в нормальных мышцах. Поэтому тип IIB волокон, предположительно, наиболее чувствительный к миостатину. В этом исследовании мы показали, что IIA волокна также подвергаются гипертрофии в ответ на торможение миостатина в камбаловидной и EDL. Этот эффект является критическим для лечения человека, а во взаимодействии с типом волокна и сдвигом к более быстрому MHC, гипертрофия изоформ IIA может привести к увеличению производительной силы, несмотря на почти полное отсутствие типов волокон наиболее чувствительными к торможению миостатина.
Это необходимо для установления безопасности торможение миостатина на дистрофическое сердце, потому что кардиомиопатия почти повсеместно развивается у людей 18 лет с мышечной
дистрофией Дюшенна. Отсутствие миостатина, как уже сообщалось ранее, не имеют влияния на функцию сердца у животных с блокадой миостатина или MDX / MSTAT KO трансгенных мышей. Исследования этого вопроса были либо краткосрочные или полагаться на генетическую терапию, которая имеет ограниченное клиническое значение. Вагнер и соавт. не наблюдали никаких изменений в размерах сердца и его функциональных параметров в возрасте 24 месяцев у MDX / MSTAT животных KO. Тем не менее, у MDX мышей в этом исследовании не развивается дилатационной кардиомиопатии в возрасте 24 месяцев, как у MDX мышей, и мыши были неотличимы от обычных C57 Bl / 6 по функциональным параметрам. Отсутствие дилатационной кардиомиопатии у старых мышей MDX в отличие от других исследований, в которых эхокардиографические изменения указывают на ее признаки, было впервые отмечено у 9-11 месячных мышей, и прогрессировало сильное снижение фракции выброса до 35% в 21 месяц. В нашем исследовании торможение миостатина не влияет на вес сердца у нормальных животных. Однако у MDX животных был на 20% больше вес сердца в возрасте четырех месяцев и на 40% больше в одиннадцать месяцев. Маловероятно, что увеличение массы сердца произошло просто за счет увеличения в размерах, пропорционально массе тела. Бартон и др.. изучали у MDX мышей экспрессию положительного фактора роста IGF-I только в скелетных мышцах без системных эффектов. В данном исследовании увеличение мышечной массы и веса тела были обнаружены, но не изменяя сердца веса. Хотя воздействие миостатина торможение на прогрессирование дилатационной кардиомиопатии у мышей MDX или в более тяжелых дистрофических кардиомиопатии неизвестна, необходимо дальнейшее расследование до внедрения миостатина основе терапии для лечения болезненных состояний, которые включают в себя вовлечение сердца. Различия в размерах сердца или функции в модели MDX после ингибирования миостатина, возможно, не наблюдалось ранее в связи с менее эффективным торможением миостатина или краткосрочными схемами лечения. Возможным механизмом наблюдаемой гипертрофии сердца является снижение сигнализации миостатина через рецепторы активин IIB, которые экспрессируются на том же уровне (рис. 8). До сообщений об участии миостатина в ремоделировании сердца, есть данные о регуляции миостатина в кардиомиоцитах граничащих с регионом инфаркта в сердце у овец. Эти данные позволяют предположить, что в то время как миостатин не участвует в регуляции размера кардиомиоцитов в нормальном сердце, это может быть важным негативным регулятором размера кардиомиоцитов при патологических состояниях, которые вызывают ремоделирование сердца. Потеря сигнализации миостатина в этих условиях может привести к ускорению гипертрофии кардиомиоцитов и в конечном итоге прогрессированию сердечной недостаточности. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы определить, как наблюдаемые изменения в массе сердца и функции развиваются с течением времени. Печень опосредованная сверхэкспрессия dnMstat имеет ряд важных преимуществ по сравнению с известными экспериментальными подходами, направленными на подавление миостатина. Клинические испытания с использованием нейтрализующих антител, направленных на миостатин, не улучшали функции мышц и увиливали мышечную массу у взрослых пациентов с мышечной дистрофией. Если внедренный в клиническую практику, любой подход, который включает в себя инъекции белка на основе ингибиторов, таких как антитела или растворимый рецептор активин IIB, потребуют пожизненной терапии, при использовании AAV ингибитора требует только одной инъекции для достижения высокого уровня стойкой экспрессии трансгена. Существует ограниченная возможность иммунного признания трансгенных продуктов, таких как dnMstat совпадающих с эндогенным пропептидом, за исключением одной точечной мутации. Кроме того, есть свидетельства того, что производство и секрецию в печени может вызвать толерантность к чужеродным пептидам. Подход с активин рецепторами IIB и другими не специфическо связывающих миостатин белков, таких как фолистатин, могут иметь ограниченное клиническое применение, так как TGF-бета сигнализация в нескольких органах и системах может быть нарушена в связи с широким распределением тканевых рецепторов активин IIB. Печеночная трансдукция позволяет также избежать технических препятствий прямой трансдукции дистрофических мышц. В дополнение к сложности переноса генов на всю мускулатуру в больших моделях животных и людях, долгосрочная трансдукция дистрофических мышц AAV без стабилизации мембран не представляется возможной (неопубликованные наблюдения ER Бартон и HL Суини, [20], [21 ]). Это наблюдение противоречит отчету о торможении миостатина после внутримышечной инъекции AAV 2/1 более двух лет. Однако не представлено никаких доказательств того, что трансгены присутствуют в обращении. Наш подход
|
Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 4 |
