Стратегия обогащения клеток с MGMT (P140K) для пересадки в скелетные мышцы (стр. 3 )

Рисунок 5

Мы также характеризовали  CD34 + популяцию с использованием FACS анализов. В ряде исследований сообщается, что  полученные стволовые и спутниковые предшественники мышечных клеток у мышей обычно выражают CD34 и не  экспрессируют CD45. Среди них субпопуляции спутниковых клеток предшественников не экспрессируют  Sca-1, в то время как другие, такие как мышечные стволовые клетки, мезоангиобласты все экспрессируют Sca-1. FACS анализ показал, что CD45-ve/Sca-1-ve клетки составляли примерно 13% CD34 + VE клеток, выделенных из мышц регенерирующим по сравнению с 31% в  неповрежденных мышцах (Рис. 5E).Представление CD45-ve/Sca-1 + субпопуляции  было одинаково в неповрежденных и регенерирующих мышцах у 59 и 56%, соответственно (Рис. 5E).

Немышечные клетки, таких как эндотелиальные предшественники, моноциты и макрофаги привлекаются к месту травмы в скелетных мышцах. Эти клетки играют важную роль не только в развитии активации и пролиферации стволовых клеток, а также в удалении ткани мусора и участии в реваскуляризации. Для оценки представления таких опорных клеток в CD34 + популяции FACS анализ проводился для количественной оценки доли CD133 + е (маркер эндотелиальных клеток-предшественников), CXCR4 + е (рецепторы для цитокинов стромальные, полученные фактор-1 [SDF -1]) и CD11b + VE (маркер для моноцитов). Каждая из этих трех подгрупп составила очень небольшую часть CD34 + VE клеток, выделенных из неповрежденных мышц примерно на 3% -5% (Рис. 5E). Тем не

менее,  при мышечной регенерации процент значительно увеличится в CD34 + популяции: 30% CD133 + , 24% CXCR4 + , 66% CD11b +  клеток (Рис. 5E). Наличие этих опорных клеток в значительных количествах в CD34 + популяции клеток из  регенерирующих мышц  может оказаться полезным для распространения донорских стволовых клеток после трансплантации.

Увеличенное  выживание CD34 +  MGMT (P140K) донорских клеток и образование De Novo мышечных волокон

Чтобы проверить, может ли защита и селективное обогащение MGMT (P140K)-экспрессирующих клеток  происходить в естественных условиях после трансплантации, доноры CD34 + клеток из  мышцы  MGMT (P140K) тг / тг или  C57BL/6JArc мышей дикого типа  пересаживают в EDL мышцы  реципиента дикого типа C57BL/6JArc мышей. Донорские клетки вводятся  в  мышцы реципиента вместе с нотексином (0,2 мкг), чтобы вызвать дегенерацию здоровых мышц. Мыши реципиенты  были разделены на три группы с пятью мышами или более в каждой группе: Группа А (дикий тип клеток донора только), Группа B (дикий тип донорских клеток с BCNU + O6BG), Группа C (MGMT [P140K] тг / тг клеток донора с BCNU + O6BG).

Мышцы реципиента были собраны через  7 дней после трансплантации, а также процент мужской ДНК был определен с использованием количественной ПЦР. В группе А (n = 5), небольшая часть от общего числа ДНК (0,39% ± 0,05% SD) был донорского происхождения (рис. 6, группа А). Эта группа представляет собой обычный протокол трансплантации донорских клеток, которые пересаживают в мышцу получателя  без какого-либо отбора. В группе В (n = 8), высокая доля ДНК донора (2,1% ± 0,6% SD), возможно, отражает цитотоксический эффект BCNU/O6BG лечения на мышцы регенерирующей эндогенной популяции стволовых клеток (рис. 6, Группа B). В этой группе только донорские клетки, которые вышли из клеточного цикла во время трансплантации выжили бы, так как пролиферирующие клетки дикого типа  были также подвержены цитотоксическому эффекту BCNU/O6BG  во время пересадки. Мышцы реципиентов из группы С (п = 10) содержат самый высокий процент (6,4% ± 1,7% SD) донорской ДНК (рис. 6, группа C), что свидетельствует о защитном эффекте MGMT (P140K) против цитотоксических эффектов BCNU / O6BG, и привело к селективному выживанию и обогащению донорских клеток

Рисунок 6

Когда  мышцы из группы B (n = 5) и С (п = 5) были собраны через 14 дней после трансплантации, мышцы из двух групп показали замечательную разницу в размерах (ср. рис. 7А и 7D). Гистологическое исследование показало отсутствие нормальной реакции восстановления в мышцах группы B  (дикий тип доноров),  большинство ткани занимают мононуклеарные клетки (рис. 7б, 7в). Это говорит о том, что повышение количества клеток дикого типа донора в BCNU/O6BG-обработанных  мышцах не проявляется как повышение регенерации мышц. В отличие от группы C  мышц с донорскими клетками MGMT (P140K) трансгенных мышей, показавших нормальную реакцию регенерации, с обильными мышечными волокнами, содержащими централизованно ориентированные ядра, что свидетельствует о регенерации волокон (рис. 7E, 7F).

Рисунок 7

Дискуссия.

MGMT (P140K)-опосредованное  обогащение клеток доноров после трансплантации стволовых клеток в скелетные мышцы

Наши результаты дают доказательство правильности концепции того, что MGMT (P140K)-опосредованная BCNU/O6BG селективная стратегия  обогащения может быть успешно применена в соматических стволовых клетках скелетных мышц. Эта стратегия была разработана для прижизненного обогащения гемопоэтических стволовых клеток с доказанной эффективностью. Негемопоэтическое  применение стратегии  на сегодняшний день показало, что клетки костного мозга экспрессирующие MGMT (P140K) можно прививать в легких. Здесь мы покажем, успешное приживление MGMT (P140K) экспрессирующих  CD34 + клеток  после трансплантации  скелетных мышцах, обрабатанных  алкилирующим агентом. Насаждение популяции клеток донора может включать в себя клетки спутника, а также другие стволовые клетки, экспресирующие  антиген CD34 на момент  изоляции. Кроме того, другие немышечные  типы клеток  в пределах CD34 + популяции клеток-доноров могли бы обеспечить косвенную поддержку приживления донорских мышечных стволовых  клеток и образование  волокон.

В предыдущих исследованиях с участием  трансплантации стволовых клеток,  выживание клеток донора в  трансплантации хозяину было одной из основных проблем. Выживание и приживление MGMT (P140K)-экспрессирующих  донорских клеток, показаное в этом исследовании, подтверждает важность восприимчивости  хозяина в начале выживания и последующего распространения донорских стволовых клеток. Концепция кондиционирования принимающей ниши привела к использованию нелетальных доз облучения для абляции деятельности клеток-хозяина. Тем не менее существуют два основных аргумента против такого метода:в том числе вопрос безопасности применения высоких доз облучения для достижения значимого кондиционирования ниши хозяина  и недискриминационный характер облучения, в результате чего клетки донора в равной степени подвержены повреждениям, если  последующие дозы облучения применяются. Эта стратегия может обеспечить эффективную терапию для лечения заболеваний, при которых конкретные мышцы страдают, таких как окуло-глоточная мышечная дистрофия, в сочетании с вирусной трансдукцией донорских стволовых клеток для исправления генетических мутаций. Кроме того, ограниченная локальная доставка алкилирующих агентов, используемыех в этом исследовании, подчеркивает безопасность этого способа доставки. Это обнадеживает, учитывая, что клеточная терапия для замены неблагополучных взрослых стволовых клеток вследствие старения и в результате различных генетических / дегенеративных заболеваний в настоящее время рассматривается во многих различных типах тканей, включая легкие расстройства, хронические травмы печени, желудочно-кишечные расстройства и  I и II тип сахарного диабета. Наши данные подтверждают возможность применения MGMT-опосредованной  стратегии обогощения клеток донора в других типах тканей и органов, где  клеточная терапия существует как возможный вариант лечения.

Индукция эндогенной регенерации  мышц после трансплантации донорских клеток CD34 +  экспрессирующих MGMT (P140K)

Неожиданное открытие, что эндогенные клетки вносят значительный вклад в регенерацию  BCNU/O6BG-обработанных мышц получателя после трансплантации MGMT (P140K)-экспрессирующих клеток донора возникает вопрос, какие факторы и / или типы клеток маршалируются  MGMT (P140K)экспрессирующими  клетками и почему? В отсутствие пересаженных MGMT (P140K)-экспрессирующих клеток, эта мышца не в состоянии самостоятельно регенерировать после травмы и медикаментозного лечения (за этим последовало до 90 дней, на рис. 3G, 3H). Мы полагаем, что фактор (ы), которые выделяется при образовании донорно-производных мышечных волокон, привлекают клетки, которые способны к миогенной дифференциации. Одним из таких кандидатов является ?-хемокин (SDF-1), хемоаттрактант для клеток с  G-белками рецептора CXCR4. Это хорошо установлено, что SDF-1 освобождается из регенирирующих  мышц, но что более важно, что недифференцированные спутниковые клетки мышц  экспрессируют  CXCR4 и реакция  хемоаттрактанта  обеспечивается наличием  SDF-1 через фосфорилирование p42 / 44 митоген-активированной протеинкиназы (МАРК) и AKT серин-треонин киназы.

Поэтому вполне возможно, что клетки-сателлиты, проживающих в мышцах, прилегающих к  EDL получают  MGMT (P140K) донорских клеток мигрируют в эту мышцу и способствуют регенерации в ответ на освобождение  SDF-1 из волокон, образованных из донорских клеток. Тем не менее, количество этих клеток, проживающих в соседних мышцах будет сокращено, потому что при  местных внутривенных инъекциях с последующей 2-х минутной блокадой кровотока в проксимальном отделе задних конечностей были бы подвержены все соседние группы мышц (и их резидентные клетки спутники) в задней конечности  последствиям BCNU. После алкилирования клетки не смогли бы пройти деление, тем самым уменьшая вклад сателлитных клеток из соседних мышц.