Стратегия обогащения клеток с MGMT (P140K) для пересадки в скелетные мышцы (стр. 1 )

Стратегия обогащения клеток с MGMT (P140K) для пересадки в скелетные мышцы.

Antonio S. J. Lee1, Prathibha Kahatapitiya1, Belinda Kramer1, Josephine E. Joya2, Jeff Hook1, Renjing Liu2, Galina Schevzov1,3, Ian E. Alexander4, Geoff McCowage5, Didier Montarras6, Peter W. Gunning1,3,7, Edna C. Hardeman2,8,§,*

Article first published online: 5 FEB 2009

DOI: 10.1002/stem.28

Введение

Клеточная заместительная терапия с использованием стволовых клеток в настоящее время вышла на первый план медицинской науки. В сочетании с генной терапией, трансплантация стволовых клеток является потенциальным лечения условий, которые влияют на широкий спектр заболеваний, включая расстройства центральной нервной системы, таких как болезнь Паркинсона, мышечных расстройств, таких как мышечная дистрофия, или рака, такого как лейкемия. В настоящее время трансплантация гемопоэтических стволовых клеток в сочетании с генной терапией является наиболее устоявшейся формой клеточной терапии. Высокий уровень успеха трансплантации гемопоэтических стволовых клеток в основном достигнут за счет эффективной доставки донорских клеток через кровеносную систему в костном мозге. Кроме того, обеспечены получение высоко пролиферативных гемопоэтических стволовых клеток в результате эффективной в естественных условиях пролиферации  и существенные уровни приживления донорских клеток. Новейшие разработки в области трансплантации гемопоэтических стволовых клеток привели к стратегии выборочного обогащения клеток  донора с преимуществом в выживании в тканях реципиента путем специальной обработки.

Большинство химиотерапевтических агентов имеют нежелательный побочный эффект - миелосупрессию, что приводит к подавлению иммунной системы. Стратегии для селективного обогащения донорских  гемопоэтических стволовых клеток для улучшения приживления первоначально были разработаны для лечения миелосупрессии. Есть много исследований, которые изучали  различную лекарственную устойчивость в естественных условиях для выбора стратегии обогащения, среди которых, наиболее эффективная стратегия использует ген-опосредованной резистентности О6-метилгуанин-ДНК-метилтрансферазы (MGMT) (P140K) [14 -19]. MGMT (P140K), который является мутантной формой гена MGMT лекарственной устойчивости. MGMT  имеет возможность восстановить, вызванное химиотерапией алкилирование ДНК, тем самым делая химиотерапевтические препараты неэффективными для  лечения рака [20, 21]. Применение  O6 бензилгуанина (O6BG) в комбинации с химиотерапией  приводит к торможению MGMT, делая химиотерапевтические препараты более эффективными. . Стратегия обогащения MGMT (P140K)-опосредованных донорских стволовых клеток  опирается на комбинированние цитотоксического действия алкилирующей химиотерапии плюс O6BG на эндогенные стволовые клетки хозяина и лекарственную устойчивость пересаженных клеток, экспрессирующих MGMT (P140K). Это  стратегия была продемонстрирована для достижения 75% -100% приживления донорских клеток.

Скелетные мышцы не так хорошо применимы  для трансплантации клеток, как кроветворная система, несмотря на их способность к быстрой регенерации после травмы. Трансплантация стволовых клеток скелетных мышц  изучалась  с 1980-х [25-27]. Первое применение трансплантации стволовых клеток  мышц была проведена у мышиной модели мышечной дистрофии Дюшенна (МДД) и привели к формированию мышечных волокон экспрессирующих дистрофин. Однако последующее клиническое применение трансплантации стволовых клеток в мышцы не показали существенных функциональных улучшений у  пациентов  с МДД. Неэффективное приживление было связано с гибелью клеток донора сразу же после трансплантации в результате иммунного отторжения и / или конкуренции эндогенных клеток и неэффективной миграции донорских клеток от места инъекции для широкого приживления.

В этом исследовании, мы проверяем возможность применения MGMT (P140K)-опосредованной селективной стратегии обогащения для  трансплантации клеток в  скелетные мышцы как органа выбора. Мы показали, что клетки с присвоенной лекарственной устойчивостью могут быть выборочно обогащены в пробирке и сохраняются в естественных условиях после введения химиотерапевтического агента, 1,3-бис (2-хлорэтил)-1-нитрозомочевины (BCNU) в сочетании с O6BG. Сингенная трансплантация подтвердила преимущество выживания лекарственно-устойчивых клеток донора и привело к формированию де-ново волокон мышцы. Кроме того, после приживления, пересаженная популяция  гетерогенных лекарственно-устойчивых клеток донора в состоянии вести эндогенную регенерацию.

Материалы и методы.

Клеточная культура и ретровирусная трансдукция.

C2C12 клеток и миобластов человека культивировали, как описано ранее. MFG-MGMT-P140K ретровирусные векторы были построены с использованием ретровирусной основы MFG, как описано ранее. Векторный супернатант собирали из РА317 клеток, трансфицированных MFG векторной плазмидой и подвергли  препарат обработке  с использованием 10 мкМ O6BG (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, http://www. ) и 100 мкМ BCNU (Bristol-Myers-Squibb, Noble Park North, Австралия, http://www. . au). Для трансдукции C2C12 клеток и миобластов, векторный  супернатант использовали как замену  культуральной среды в течение ночи, прежде чем заменить  нормальной средой роста на следующий день.

Инъекция нотексина животным.

Все хирургические процедуры были одобрены Детским медицинским научно-исследовательским институтом и Комитетом  по этике, и проведены  в соответствии с австралийским кодексом практики по уходу и использованию животных в научных целях. Мышей анестезировали кетамином (0,1 мг / г, б. Мас.), и ксилазином (0,01-0,02 мг / г б. Мас.)  и 1-см разрез кожи был сделан либо на передней или задней поверхности  задних конечностей.

Для исследования в естественных условиях, чтобы определить влияние BCNU и O6BG на регенерацию мышц, 0,2 мкг Нотексина  (40 мкг / мл: Latoxan, Valence, Франция, http://www. ) и 0,1-0,5 мг BCNU (33,3 мг / мл) смешивают и вводят внутримышечно (10 мкл) в длинный разгибатель пальцев (EDL)  с использованием 50-мкл  шприца  (Hamilton компании, Reno, NV, http:// www. ). После восстановления от анестезии, O6BG (30 мг / кг массы тела в PEG400) вводили внутрибрюшинно.

Для выделения донорских клеток, 8-12-недельным самцам  C57BL/6JArc дикого типа или MGMT - трансгенным мышам  вводили 0,1 и 0,4 мкг нотексина  внутримышечно в EDL и переднюю большеберцовую (TA) мышцу, соответственно. Мышцы были собраны через 3 дня для изоляции  донороских клеток.

Выделение донорских клеток CD34 +

Протокол  был принят  Montarras и соавт.  и выбор  CD34 + клеток  был выполнен с помощью магнитного EasySep-PE разделения клеток Kit (Stem Cell Technologies, Ванкувер, Британская Колумбия, Канада, http://www. ) в ??соответствии с инструкциями изготовителя с анти-CD34 биотинилированными антителами (eBioscience Inc, San Diego, CA, http://www. ; 1:50).

Трансплантация донорских CD34 + VE клеток в сочетании с BCNU (IV) и O6BG (IP)

Реципиентам женского пола  C57BL/6JArc мышам дикого типа (8-12-недельного возраста) вводят внутримышечно донорские CD34 + клеток  (60.000 клеток в 5 мкл стерильной PBS) смешиванные  с 5 мкл нотексина (40 мкг / мл). При  каждой пересадке реципиенту, в  большую подкожную вену был выставлен катетер  ??на задней поверхности задних конечностей и  был помещен  жгут для временной блокировки  притока крови [40] и BCNU (0,2 мг в 50 мкл) вводили внутривенно. После инъекции стерильными ватный тампон был размещен  для предотвращения кровотечения, в то время как приток крови был заблокирован в течение 2 минут. После восстановления от анестезии, O6BG (30 мг / кг массы тела) была доставлена ??внутрибрюшинно.

Иммунохимия и флуоресцентная  гибридизация

Иммунодетекция  ?-актинина-2 была выполнена, как описано ранее, и обнаружение MGMT и дистрофина проводили с помощью мышинного комплекта (Vector Laboratories, Burlingame, CA, http://www. ; номер продукта FMK -2201) в соответствии с инструкциями изготовителя с первичными антителами: анти-человеческими MGMT (Neomarkers, Фремонт, штат Калифорния, http://www. , 1:100) и антидистрофиновыми антителами (NCL-DYS, Novocastra, Ньюкасл-апон-Тайн, Великобритания, http://www. novocastra. co. uk, 1:200). Флуоресцентная  гибридизация (FISH)  была выполнена как описано ранее.

Вестерн блотанализ.

Вестернблотанализбылвыполненкакранее описано. Первичные антитела использовались к антисаркомерному тропомиозину, анти –а-актину2,анти - MyoD.

Флуоресценная  сортировка клеток

Изолированные клетки фиксировали в 1% параформальдегиде в течение 30 минут и промывают в FACS буфере (PBS, 0,1% BSA, 0,1% азида Na) и  в 0,1% Твин-20 в течение 1 часа при 37 ° C (для обнаружения внутриклеточных маркеров).  Клетки инкубировали со следующими первичными антителами : анти-CD34 биотинилированные антитела (eBioscience Inc, San Diego, CA, http://www. , 1:100) в течение 30 минут при 4 ° С, мышинные  анти-человеческие моноклональные антитела, MGMT (Neomarkers, Фремонт, штат Калифорния, http://www. , 1:25) в течение 2 часов при температуре 4 ° С, анти-мышиные CXCR4 FITC-конъюгированные антитела (R & D Systems, Minneapolis, http://www. ; 1:5) в течение ночи при 4 ° С, анти-мышиные CD133 FITC-конъюгированные антитела (eBioscience Инк, 1:50) в течение ночи при 4 ° С, анти-мышиных стволовых клеток антигена 1 (Sca-1) (Ly-6A / E) PE-Cy5.5-конъюгированных антител (Caltag Laboratories, Burlingame, CA, http://www. , 1:100) в течение 30 минут при 4 ° С, анти-CD45 мышинные FITC-конъюгированные антитела (Caltag лабораторий; 1:100) в течение 30 минут при 4 ° С, анти-мышинные CD11b PE-конъюгированные антитела (eBioscience Инк, 1:100) в течение 30 минут при 4 ° C.