Функциональное восстановление после фиброза при помощи галофугинона в сердце и скелетных мышцах у mdx мышей (стр. 2 )

Функциональные меры исхода  лечения.

Силу захвата  лапы  измеряли еженедельно с помощью калиброванного тензодатчика. Производительность измерялась как пик средней  тяги  из пяти испытаний, как сообщалось ранее. Данные были нормированы на массу тела и по сравнению с течением времени между группами. Окончательное  исследование  было через 4 дня после предыдущего испытания, чтобы проверить функциональное воздействие повторяются  упражнения. Степень физической нагрузки повреждения мышц была определена в финале 24-часового периода добровольного упражнения с использованием синего красителя Эванса (EBD), как описано. EBD + волокна были подсчитаны и выражается в виде доли от общих  волокон для каждого раздела. Общая дыхательная функция была измерена в естественных условиях от 1 до 2 дней до эвтаназии с использованием барометрической плетизмографии (Buxco, Трой, штат Нью-Йорк).). Аэрозоль метахолина вводят с  увеличением  дозы ступенчато ??(3,1, 6,25, 12,5, 25 и 50 мг /

мл), начиная с физиологическим раствором в качестве. Между дозами  метахолина  дыхательный объем  вернулся  к  базовому  или стабильному  минимальному  значению. ЭхоКГ исследования были проведены для оценки в естественных условиях сердечной функции мышей, как сообщалось ранее (17, 47). С помощью неинвазивного 13-МГц зонда (Vivid 7, General Electric Medical Systems, Milwaukee, WI) мыши были обследованы. Сердца были обследованы в двумерной парастернальной короткой оси зрения, и в три М-режиме эхокардиографии были записаны.  Конечно-диастолической  диаметр, конечный систолический диаметр, толщина задней стенки, и фракции укорочения были измерены. Конечный систолический и конечный диастолический объемы были измерены от парастернальной длинной оси зрения с использованием  геометрической  модели  вытянутого эллипсоида, а фракция выброса ЛЖ была рассчитана. Сердечный выброс рассчитывается как произведение ударного объема и  частоты сердечных сокращений было.

Статистический анализ.

Данные были проанализированы с помощью двух-дисперсионного анализа (ANOVA) или повторных измерений ANOVA, чтобы определить эффекты лечения и длительности лечения (5 или 10 недель), по мере необходимости. Группы сравнивали с помощью T-теста или теста Тьюки для оценки данных или с помощью ?2 статистики распределения частот. Данные (среднее ± SE) были собраны без каких-либо знаний о группе лечения. Уровень значимости был установлен на уровне вероятности Р <0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Фиброз и экспрессия генов  коллагена.

Лечение галофугиноном не приводит к какой-либо токсичности или изменениям  в массе тела. Транскрипты коллагена I и III  были обнаружены в мышцах  MDX  мышей  (рис. 1А). Большинство из  ядер экспрессировавшие  коллаген были расположены в промежуточном отсеке между мышечными волокнами. Существовало  дифференциальная экспрессия  коллагена между мышцами и для коллагенов:  передняя большеберцовая содержала  больше  ISH + клеток, а затем диафрагма, четырехглавая  мышца и сердце. Эта картина была такой же, в каждой группе. Распределение мононуклеарных клеток, экспрессирующих коллагена типа I и III во всех четырех тканях сократилось  через  5 и 10 нед (P <0,001 и р <0,02 соответственно;. Рис. 1, B и C). Между 5 и 10 неделями  лечения  увеличение экспрессии коллагена в контрольных (необработанные мыши MDX); лечение уменьшено экспрессию коллагена. Центральные ядра в регенерирующих волокнах были также отмечены экспрессией  коллагена I (рис. 1, внизу) и III (данные не представлены) в четырехглавой  и пердней большеберцовой мышце. Количество коллагена экспрессируемое  центральным ядром уменьшилась после лечения через  5 и 10 недель по сравнению с контрольными необработанными MDX-мышами (Р ? 0,02 для мышц) (табл. 1).

Гистологические наблюдения показали, что переменный  фиброз наблюдается в пределах каждого среза  мышц, среди мышц у каждого животного, так и среди животных в каждой группе. Окрашивание отображает  более интенсивную  Сириус красную  окраску, что свидетельствует о наличии фибриллярного коллагена больше  в диафрагме, чем в четырехглавой мышце (рис. 2). Расчетная общая средняя интенсивность  пятен окрашивания, на четырех углах отбора проб выявила увеличение фиброза диафрагмы  в обеих обработанных и необработанных группах мышей MDX между 5 - и 10-недельными  моментами времени. Были также аналогичные уровни двулучепреломляющего  коллагена (средняя интенсивность на квадратный микрометр) в двух мышцах через  10-недель. Некоторые из центральных  миоядер в регенерированных волокнах  окрашивались  от  розового  до красного  Сириусом красным, однако,  ни одно из этих ядер не показало  двулучепреломления при просмотре в поляризованном свете под любым углом (рис. 2В).

Лечение галофугиноном в течение 10 недель вызывало скромное, но значительное снижение окрашивания Сириус красным  как в диафрагме  и четырехглавой мышце по сравнению с MDX-контролем  (P <0,001;. Рис 2С).Оценка  фиброза при  трехцветном  окрашивании Массона не показывают изменений при  лечении (данные не показаны).

Содержание коллагена, HGF, и SMA.

Содержание коллагена значительно различаются в  мышцах во всех группах  необработанного контроля (P <0,001 в обоих 5 и 10 недель) и леченных мышей (P <0,05 в обоих 5 и 10 недель).  Содержание белка коллагена было выше в  сердце, чем в диафрагме и четырехглавой как для обработанной и необработанной MDX мышей после 5 (Р <0,001) и 10 недель (P <0,01). Лечение в течение 5 недель уменьшило содержание коллагена в четырехглавой, передней большеберцовой мышцах и сердце (P <0,01 за каждый) по сравнению с необработанным контролем MDX, но не было никаких существенных изменений в содержании коллагена в диафрагме в связи с  лечением. Не существовало значительного влияния лечения на содержание коллагена в течение 10 недель, вероятно, из-за большой  изменчивости внутри группы в этом возрасте.

HGF был увеличен в четырехглавой мышце после 10 недель (P = 0,03; табл. 1). SMA содержание в четырехглавой был снижен после 10 недель  (P = 0,01).

Пролиферация клеток.

Галофугинон  сократил количество Ki67 +-пролиферирующих клеток в области ECM диафрагмы, четырехглавой мышцы, сердце  по сравнению с необработанным контролем MDX (P <0,05, P <0,01, P <0,05 и р <0,05, соответственно) после 5 недель (рис. 4). Существовало  одновременное увеличение мышечной клеточной пролиферации в четырехглавой  и передней большеберцовой мышцах (P <0,01 и р <0,05, соответс

твенно). После 10 недель из Halo, ECM пролиферации клеток в четырехглавой была увеличена (P <0,05).

Функциональные результаты лечения.

Производительность в силе захвата  и других  испытаний была меньше  среди MDX мышей во время и после лечения, чем у необработанного  контроля. Добровольный  ход был использован, чтобы вызвать повреждение как отдельный показатель исхода лечения  дистрофических  мышц,  восприимчивых к травмам от физических упражнений. В этом тесте  мыши, получавшие лечение,  бежали более чем в четыре раза дальше, чем  контрольные мыши (P <0,01) (рис. 5а).

Доля EBD + волокон (краситель проницаемые в результате повреждений при  физической нагрузке) служила мерой лечения воздействия на стабильность мембраны. После 12 недель лечения в четырехглавой мышце выявлено  меньше EBD + волокон, чем в четырехглавой MDX контроля (P <0,02) (рис. 5б). Мышцы от контрольных мышей показали, что доля поврежденных волокон (от 0,05 до 0,10) увеличилась в зависимости от пройденного расстояния. Атмосферная  плетизмография показала  общую  реакцию  органов дыхания (вдоха и выдоха экскурсия) как бронхоспазм. У леченных  мышей  отметили  увеличение Penh при увеличении  дозы метахолина. (P <0,01) (рис. 6). Леченные мыши  также поддерживают больший  базовый  дыхательный  объем при более высоких дозах метахолина (25-50 мг / мл), чем у  контрольных MDX (6,25 мг / мл) (р <0,01). Результаты были идентичны для мышей после 10 и 12 недель лечения.

Сердечно-сосудистая функция была измерена в естественных условиях у леченых  и контрольных  MDX мышей (n = 8 до 9/group) до лечения и после 5 и 10 нед лечения. Частота сердечных сокращений остается неизменной в течение всего периода лечения (базовый уровень: 649 ± 10, и 671 ± 9, 5 недель:  680 ± 14 и Halo678 ± 8 и 10 недель:  684 ± 10, и Halo 678 ± 9 уд / мин). Не существовало  никаких существенных изменений в LV конечно-диастолическом  диаметре, LV конечно - систолическом диаметре, межжелудочковой перегородки, задней стенки, фракции укорочения, или фракцией выброса между MDX контролем и  группой лечения  во  всех трех моментов времени. Все мыши  продемонстрировали значительную  гипертрофию  левого желудочка, что не изменилось при  лечении. Тем не менее, лечение значительно улучшило пик  систолической скорости (P <0,01) и скорости деформации (P <0,01). Кроме того,  лечение вызвало значительное функциональное улучшение качественного измерения  движения стенки желудочка (рис. 7). Эхокардиография показала LV WMAs у всех MDX мышей в начале исследования с гипокинетической дискинезией  в  стенках. Эффект галофугинона на функцию сердца был поддержан до 10 недель, и только гипокинезия наблюдалось по сравнению с широким спектром WMAs у необработанного  контроля.