Функциональное восстановление после фиброза при помощи галофугинона в сердце и скелетных мышцах у mdx мышей (стр. 1 )

Функциональное восстановление после фиброза при помощи  галофугинона  в сердце  и скелетных мышцах у mdx мышей.

Фиброз в скелетных и сердечной мышцах приводит к значительному ухудшению функциональных  свойств и снижению качества жизни при  мышечной дистрофии Дюшенна (МДД). МДД является смертельным расстройством, которое  приводит к повреждению мышц при физической нагрузке, воспалению, фиброза, и прогрессирующая  дисфункция и слабость. Первоначальное  повреждение происходит  с последующей регенерацией, но в итоге мышцы заменяются  коллагеном и жировой тканью. По мере прогрессирования болезни требуется инвалидное кресло и вентиляционная  помощь, и у пациентов  часто наблюдается  дисфункция сердца и дыхательная недостаточность. МДД вызвана мутацией в гене дистрофина; MDX-мышиная модель МДД также имеет Х-хромосомную миопатию из-за мутации дистрофина. С возрастом у мышей MDX мышцы становятся все более похожими на те, которые наблюдаются  при МДД. Значительный рост  фиброз для замены поврежденных волокон происходит  в  скелетных мышцах  и в кардиомиоцитах. В конечном счете, дистрофия имеет значительное негативное влияние на функциональную способность. Фиброз демонстрирует значительное увеличение  коллагена типов  I и III в мышцах. Фиброз регулируется  через трансформирующий фактор роста-? (TGF-?) и  фактор роста гепатоцитов (HGF), который  действует как TGF-? антагонист. HGF уменьшает фиброз за счет уменьшения активации фибробластов и переход их  в миофибробласты. HGF также играет роль в развитии почечного и легочного фиброза. Интересно, что HGF играет важную роль в активации спутниковых клеток  и их пролиферацию опосредованную через  с-рецепторы. Окончательная  роль  HGF в миогенезе и фиброзе не были изучены в отношении фиброза мышц при мышечной дистрофии. Галофугинона  гидробромид (Halo) обладает мощной антифиброзной  активностью  за счет ингибирования TGF-?-опосредованного синтеза коллагена  и фосфорилирования и активации TGF-?-зависимых Smad3 (39), которые ингибируют экспрессию  коллагена I  без изменения содержание коллагена. Это помешало синтезу коллагена и фиброзу  у мышей с  хронической реакцией  трансплантат против хозяина, и склеродермией  и снижение фиброза у крыс с легочным фиброзом, фиброзом  печени, стриктурой  уретры, и  спаечной болезнью. Таким образом, галофугинон  имеет антифиброзный эффект при острых и хронических немышечных заболеваниях. Эти сообщения привели к нашим  экспериментом  у  молодых мышей MDX, которые получают  галофугинон  в течение 8 недель (Тургеман и соавт., Неопубликованные данные).  Галофугинон вызывал дозозависимое и обратимое сокращение  содержания коллагена  в диафрагме.  Галофугинон также предотвращает  вызванный  циклоспорином  фиброз в диафрагме мыши MDX, снижает  Smad3 фосфорилирование, и частично предотвращает  гипертрофию сердца, что является типичным признаком  кардиомиопатии. Самое главное, что  лечение галофугиноном облегчает  прогрессирование  дистрофии мышц диафрагмы и улучшает  функции  мышцы обеих конечностей (выносливость, координацию и баланс) и сердца. Эти исследования на животных поэтому предлагают  галофугинон  как предполагаемое  антифибротическое  средство для лечения ранних проявлений МДД. Тем не менее, результаты  лечения по устранению  дистрофии остается неизученным. На основании тяжелого  функционального  воздействия хронического фиброза на мышечную и сердечную функцию при  МДД, эксперименты были разработаны, чтобы проверить гипотезу, что данный препарат  был бы эффективен в уменьшении  фиброза у пожилых мышей MDX. Результаты показали, что пониженное содержание SMA и экспрессии  коллагена, повышенная HGF содержание, усиленное разрастание мышечных клеток были связаны с улучшением функционального результата в конечностях, дыхательной и сердечной мышцах  мышей MDX.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалы.

Галофугинон  поставили  Biopharmaceuticals Collgard (Тель-Авив, Израиль).

Поликлональных антиколлагеновые ?1 (I)-антитела и антитела к HGF были получены из  Sigma (St. Louis, MO), анти-GAPDH и анти-Ki67 антитела (ab15580, который реагирует на мышь Ki67) были получены из Abcam (Кембридж, Великобритания) и ?-SMA антитела были получены  от Санта-Крус (Santa Cruz, CA). Вторичные антитела были получены из Санта-Крус и Абкам. Последовательности плазмиды коллагена I и III были получены из ATTC (Manassas, VA).

Животные и экспериментальное проектирование.

Mdx дистрофическим мышам (8  9 месячных  старых; Jackson) внутрибрюшинно вводили 3 раза / неделю галофугинон (3 мкг / г массы тела, середина диапазона ранее эффективной дозы). В контрольной группе были подобранные  по возрасту MDX мыши, которые  получали физиологический раствор внутрибрюшинно. Лечение продолжалось в течение 5, 10 или 12 недель (п = 4 5). Эксперименты были проведены в соответствии с руководящими принципами Канадского совета  по уходу за животными. После эвтаназии  диафрагма, сердце, четырехглавая  мышца  и передней большеберцовой (TA) мышцы были собраны и заморожены  в пробирках  для последующего анализа  и гистологических  исследований.

Гистологические анализы экспрессии  коллагена и фиброза.

Экспрессия  коллагена I и III  в мононуклеарных клетках была использована в качестве общего показателя синтеза коллагена. Коллаген ?1 был синтезирован из ATCC кДНК-клона (номер по каталогу 5876788, 3823337  и инвентарный номер GenBank BF662620) с использованием стандартных протоколов. Рибопроб (~ 400 пар оснований в длину) обнаружены последовательности генов из базы 143 до 408, до 0,005 нг РНК. Коллаген ?3-рибопроб  был синтезирован из ATCC кДНК-клона (каталожный номер 1058119, 789709 обозначение и инвентарный номер GenBank AA387470). Это рибопроб  имел  1337 и 1754 пар оснований и обнаружить последовательность  коллагена III генов между базами 2053 и 3473, до <0,0187 нг РНК. Количество мононуклеарных клеток, окрашенных положительно на коллаген I и III,  подсчитывали в пяти областях  на ? 400 по длинной оси каждой секции (по одной от каждого животного). Распределение ISH + клеток оценивали от 1 до 3 (1, отдельных клеток, 2, кластер из 2-4 клеток, а также 3, 5 или более клеток в группе) в соответствии с количеством ISH + ядер в регионе. В тех же областях, некоторые центральные  ядра  в регенерированных волоконах были отмечены  ISH  для транскриптов коллагена.  Волокна, содержащие  ISH + центральные ядра были подсчитаны и выражаются в виде доли всех центрально расположенных  ядерных волокон. Центральный индекс зарождения (CNI) был также рассчитан в  передней большеберцовой  и четырехглавой мышцах  при соблюдении трех полей в увеличении ? 100 вдоль длинной оси участка (по одному на животных). Коллаген был визуализирован  в разделах двумя способами. Сириус красная  окраска была использована для изучения распределения коллагена в диафрагме (5 и 10 недель) и четырехглавой мышце (10 недель только), просмотрев поля  в поляризованном свете (Zeiss Фото II микроскоп, Carl Zeiss, Thornwood, Нью-Йорк). Изображения были  сканированы  ПЗС-камерой (Sony) и анализировали с помощью вестерн блот анализа  (Empix Imaging, Mississauga, ON, Канада). В целом средняя интенсивность рассчитывается как сумма средней интенсивности в четырех углах. Второй метод был использован для оценки соединительной ткани для окрашивания коллагена ECM. Другой набор срезов  окрашивали  трехцветным методом  Массона, ECM  оценивали в  пяти полях на длинной оси каждой секции (1 на одно животное было проанализировано) с использованием 10 ? 10  сетки. Площади заполнены сине-зелеными пятнами более 25% или более, считаются положительными, а фиброз был представлен рядом положительных квадратов в виде доли от 500 в каждой секции.

Анализы на содержание  коллагена, HGF, и SMA.

Содержание коллагена определяли из экстрактов мышечных белков. Аликвоты равной концентрации белка (100 мкг) расщепляли (20 мин при 37 ° C) в 0,2% коллагеназы,  реакция была остановлена ?? буфером для образца и кипения (Хюбнер и Андерсон, не опубликовано). Образцы были погружены на 8% в гель. Одна полоса была загружена  в Витроген  (коммерческое решение 98% коллагена I и 2% коллагена III) в качестве положительного контроля (сплоченность, Пало-Альто, Калифорния). Коллаген  (190 кДа) был обнаружен с использованием антитела против коллагена ?1 (I) (1:4,000), соответствующими  вторичными  антителами, и хемилюминесценцию субстрата фенилфосфат  динатрия (CSPD, Roche Diagnostics, Indianapolis, IN). HGF и SMA содержимое определяется из образцов белка  четырехглавой мышцы с использованием стандартного  вестерн блот  анализа протоколов, использующих иммунодетекцию с анти-HGF (1:500) или анти-SMA (1:2500) антителами. Пятна  коллагена ?1 (I) были проверены на  GAPDH. Для всех пятен оптическая плотность каждой группы была нормализована к оптической плотности GAPDH (коллаген) или на миллиграмм мышц (HGF и SMA) в той же полосе.

Анализ пролиферации.

Пролиферацию клеток определяли с помощью иммуногистохимических  Ki67 (1:4,000), который определяет белок в ядрах от G1 фазы в  фазе  M. Ki67 + клеток были подсчитаны отдельно ? 400 для регионов мышцы. Клетки подсчитывали (в поле), как миогенные спутниковые клетки  (непосредственно примыкающих к волокнам) и в ECM (клеток в интерстиции между волокнами и в больших областях фиброза). Графы были сделаны в пяти областях вдоль длинной оси каждой секции (по одной от каждого животного) и были представлены как распределение пролиферирующих мышц и ECM клеток на пять полей.