ОБСУЖДЕНИЕ
Лечение в течение 10-12 недель улучшило структурный характер и функциональные характеристики поперечно-полосатых мышц у старых мышей с хорошо известными заболеваниями и дисфункцией (следуют в возрасте от 10 до 11 мес). После 5 недель лечения снизилась выражение коллагена типа I и III в четырех мышцах (передней большеберцовой, диафрагме, четырехглавой мышце, и сердце) и снижение содержания белка коллагена в трех мышцах (передней большеберцовой, сердце и четырехглавой мышце). Галофугинон также снизил ECM
пролиферацию клеток и увеличению скелетной пролиферации клеток мышц после 5 недель лечения. После 10 недель лечения в дополнение к дальнейшему снижению экспрессии коллагена I и III во всех мышцах, фиброз был сокращен в диафрагме и четырехглавой мышце, и уровень HGF был увеличен и SMA была снижена в четырехглавой мышце. Эти изменения в мышцах старых мышей MDX не влияют на CNI, индекс общего прогрессирования дистрофии. Самое главное, что изменения в мышцах конечностей, дыхательной и сердечной мышце было достаточно для значительного улучшения производительности. Функциональные достижения в мышцах конечностей уменьшили восприимчивость к физической нагрузке и более быстрому восстановлению функции после упражнений. Дыхательные мышцы показали лучшую компенсацию при использовании метахолина, и сердечная мышца продемонстрировала заметное улучшение в желудочковой WMAs. Новый подход к измерению содержания коллагена с использованием предварительного переваривание коллагеназой образца, новые наблюдения экспрессии коллагена в центральных ядрах в регенерировавших мышечных волокнах, и новая информация о воздействии дифференциации между мышцами расширит наше понимание основных процессов мышечной дистрофии у мышей. В целом, галофугинон является мощным антифиброзным агентом, который вызывает функционально значимое ослабление существующего фиброза в скелетных и сердечной мышцах при одновременном снижении синтеза нового коллагена. Наши выводы имеют большое значение для перевода основных выводов исследования на животной модели для клинического применения в лечении МДД и, возможно, других состояниях, при которых мышечный фиброз ограничивает функции. Лечение снижало экспрессию генов для коллагена типа I и III во всех мышцах. Это согласуется с предыдущими докладами эффектов галофугинона при фиброзе в немышечных тканях и в мышцах дистрофических молодых мышей MDX. Поскольку взаимоотношения между дифференциацией мононуклеарных миогенных клеток и экспрессией и отложение коллагена в интерстиции клеток, которые расходятся с миогенной линией, распределение ISH + клеток было использовано в качестве индикатора синтеза коллагена (и последующая секреция) в различных мышцах. Аналогично, экспрессия коллагена отображает уровень фиброза развивается в мышцах мышей MDX. Поэтому, хотя механизмы эффектов галофугинона исследуются, текущие результаты снизили коллаген I и III у старых MDX мышей. У молодых мышей MDX, снижение экспрессии коллагена сопровождается снижением фосфорилирования Smad3 и снижение фиброза, предполагая, что подобные пути могут быть направлены на снижение выражения коллагена и содержание у старых мышей MDX. Mdx мышцы, как сообщается, проявляют признаки фиброза очень рано [начиная с 3 недель в диафрагме и становится заметным через 5 недель (49, 50)]. Фиброз растет с увеличением возраста и в результате большая мышечная активность травмирует волокна. Коллаген в диафрагме MDX постепенно увеличивается на протяжении всей жизни, как показано на мышцах диафрагмы в данном исследовании. Исследования о том, что MDX мышцы не имеют минимальных фиброзно-жировых изменений в соединительной ткани, как правило, интерпретируется по сравнению с тяжелыми изменениями, наблюдаемыми в МДД мышцах. Тем не менее, большинство исследований, в том числе исследования на молодых мышах MDX (Тургеман и соавт., Неопубликованные) показывают, что фиброз и экспрессия коллагена (коллагена I и III) увеличиваются с возрастом у многих MDX мышей, даже между 4 и 12 недель от роду. Изменчивость между и внутри групп мышц, возможно, были ниже, если коллаген был проанализирован путем изучения содержания оксипролина (который также связан с экспрессией коллагена), хотя коллаген содержит только 13,5% оксипролина, которое не может быть представителем общего содержания коллагена. Галофугинон вызывал снижение фиброза в диафрагме и четырехглавой мышце после 10 недель лечения, по данным исследования общей средней интенсивности окрашивания Сириус красным в полярных освещении. Эти изменения согласуются с исследованиями у молодых мышей MDX, несмотря на различные дозы галофугинона (5 мкг / г у молодых мышей по сравнению с 3 мкг / г у старых мышей).Новый протокол вестерн-блоттинга для обнаружения белка коллагена был разработан для дальнейшего исследования лечебного воздействия на мышцы у пожилых мышей. Изменение процедуры включило краткую обработку коллагеназой. Так как экспрессия коллагена и содержание 190-кДа белка коллагена и уменьшилось после 5 недель лечения, прежде чем фиброз наблюдается в 10 недель лечения, галофугинон может повлиять на молекулярные, фибриллярные конформации коллагена или предотвращения сшивания лизином перед изменением стабильной структуры коллагена, который определяется в полярном микроскопе. Галофугинон может также удалять поперечные связи, активируя металлопротеиназы: предварительное исследование матриксных металлопротеиназ (ММП) (анализировали зимографии) показал увеличение контроля над уровнями в мышцах диафрагмы у 7ми старых мышей MDX после 4 недель лечения (Pines и др.;. неопубликованные данные), в то время как MMP9 деятельность была обнаружена у молодых обработанных мышей MDX (Тургеман и др., неопубликованные данные.). Снижение белка коллагена у старых мышей MDX соответствовало бы такому же эффекту увеличения MMP9 деятельность у старых мышей. Здесь изменения могут представлять различия в созревании, стабильности или сшивки коллагена, а не общее содержание коллагена ECM. Это могло бы объяснить нахождение самого высокого уровня коллагена в передней большеберцовой мышце с использованием метода пищеварения: волокнистая соединительная ткань в передней большеберцовой мышце старых мышей может содержать наименее зрелые формы коллагена по сравнению с другими мышцами, такими как диафрагма, где фиброз обширной. Обширный фиброз в диафрагме более устойчив к перевариванию коллагеназы в подготовке одной культуры волокон (Anderson, неопубликованные данные). Кроме того, незрелый коллаген может быть более восприимчив к действию ММП. Поскольку уровень фиброза имеет сложное отношение к экспрессии коллагена, синтез, секреция, и деградация, активности ММП (или тканевых ингибиторов ММП) и TGF-? сигнализация может быть вовлечен в
механизм, с помощью которого галофугинон уменьшает экспрессию коллагена и содержание в дистрофических мышцах. Новый подход к анализу белка коллагена был разработан для данного исследования с учетом изменений в экспрессии генов коллагена, что лишь незначительно уменьшить фиброз в соответствии с гистохимическим окрашиванием. Метод имеет потенциал, чтобы выявить ранее недоступные детали отложения коллагена и созревания и изменения в связи с болезнью или лечением в тканях с первичным и вторичным фиброзом. Снижение мышечной функции при прогрессировании МДД связано со значительным фиброзом, отмеченные аномально высокие уровни коллагена I и III (18), и контрактуры хронически ограничивают диапазон движений, постуральную стабильность, и дыхательную и сердечную функции. Фиброзная ткань накапливается в мышечной ткани, чья архитектура повреждена в результате воспалительных и дистрофических процессов. Действительно, нормальные мышцы также зависят от фиброза, который развивается во время и после травмы. В основе эффекта лечения для снижения содержания коллагена и экспрессии коллагена I и III в мышцах дистрофических мышей, ткани контрактуры при МДД и другие условия могут также реагировать на лечение галофугиноном, которые улучшили бы диапазон движения и функции мышц. Снижение SMA является еще одним свидетельством антифиброзных эффекта галофугинона. Поскольку клетки синтезируют SMA после активации, миофибробласты участвуют в механическом или биофизическом ремоделировании мышц, и миофибробласты SMA + исчезают, когда больше нет никаких активных сокращение ECM коллагена. После 10 недель лечения галофугиноном SMA был снижен до нормального уровня дикого типа четырехглавой мышцы мыши. Интересно, что HGF антифиброзный белок, который противодействует TGF-? и подавляет SMA. HGF лечению удалось сократить фиброз кожи, легких и почечной ткани с помощью TGF-? торможения. Хотя предыдущие работы показали, что галофугинон действует отрицательно по течению к TGF-?, увеличение четырехглавой мышцы после 10 недель предполагает, что галофугинон может также действовать вверх по течению к TGF-?, чтобы побудить HGF синтез перекрестных помех с другими сигнальными путями. Дальнейшее изучение HGF и пролиферации клеток в диафрагме и других мышцах, чтобы подтвердить о том, что регуляция HGF и пролиферация клеток в мышцах взаимосвязаны. Увеличение числа Ki67 + клеток в мышцах после 5 недель лечения и регенерации после тренировок, согласуется с высоким уровнем HGF, которые будут способствовать миогенной клеточной пролиферации и миграции. Кроме того, поскольку ущерб от упражнений был сокращен (EBD данных) без изменения CNI, галофугинон, возможно, способствовал более эффективному ремонту с помощью HGF: снижение экспрессии коллагена и накопление, и меньше миофибробластов облегчает механические нагрузки на мембрану волокна во время тренировки, несмотря на прогрессирование дистрофии. Удивительно, что центральные ядера в волокнах регенерирующих мышц от дистрофических травм были отмечены, чтобы выразить коллаген I и III. Примечательно, что галофугинон снизил выражение генов коллагена центральных миоядер. В недавнем докладе установлено, что пролиферирующие первичные миобласты и C2C12 клетки могут выразить коллаген I. Результаты заключительных испытаний хотьбой, следовательно, причастность галофугинона в улучшении восстановлении мышц, возможно, за счет снижения отложения коллагена и сшивания, что приведет к увеличению ECM гибкости и большей активации и миграции пролиферирующих миобластов в процессе лечения. Дистрофия приводит к тяжелому дефициту дыхательной функции. В настоящее время исследования использовали плетизмографию для изучения дыхательной функции у мышей MDX. Леченные мыши имели меньший ответ на метахолин, чем в контрольной группе, что свидетельствует о снижении коллагена I и III в диафрагме во время лечения была эффективной в улучшении дыхательной функции. Функциональные улучшения мышей, продемонстрировало с использованием плетизмографии, согласуется с пониженным уровнем фиброза в диафрагме тех же животных. Сердечная деятельность была значительно улучшена лечением. Мышиная эхокардиография эффективно продемонстрировала улучшение движения стенки желудочка, которая эволюционировала от тяжелой дискинезии к более синхронным, концентрическим сокращениям желудочков. Эхокардиография является очень чувствительным инструментом для оценки структурных и физиологических показателей, которые могут выявить начало заболевания и прогрессирования (53а, 60). Прогрессирование кардиомиопатии также было приостановлено, так как движение стенки не ухудшилось от 5-10 недель лечения (по наблюдениям движения стенки ЛЖ), как это было у контрольных мышей. Хотя не было никаких количественных изменений в типичных мерах систолической функции с лечением, в том числе индексы TDI скорости и скорости деформации были рассмотрены с целью обнаружить тонкие региональные WMAs, которые могут появиться перед снижением фракции выброса. TDI параметры были ненормальные на исходном уровне в обеих группах. У мышей MDX контрольной группы TDI остался ненормальным, тогда как у обработанных мышей TDI улучшились, что свидетельствует о вызванных лечением успехах систолической функции ЛЖ с помощью этих новых мер. Хотя не было никаких доказательств дилатационной кардиомиопатии, региональные движения стенки улучшилась при лечении. Примечательно, что у молодых мышей MDX галофугинон частично предотвращает гипертрофию ЛЖ (Тургеман и соавт., Не опубликовано), что характерно для кардиомиопатии мышей MDX, наряду с фиброзом и желудочковой дисфункцией. Хотя MDX мыши с сердечно-сосудистой патологией не могут регулировать миостатин, сердечные изменения, вызванные галофугиноном (улучшенная функция и пониженное содержание коллагена и экспрессию генов) согласуются с предотвращением TGF-?-зависимой кктивацией гена и воспаления, тем самым предотвращая дальнейшее прогрессирование кардиомиопатии. При высокой частоте дисфункции ЛЖ при МДД (20% на 10 лет возраста) и целей раннего предупреждения и эффективного разрешения фиброза при явной клинической кардиомиопатии галофугинон является весьма привлекательным для клинических испытаний. Это может быть особенно ценным для исследования относительно кардиомиопатии, которая может быстро
|
Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 4 5 |
