N-ацетилцистеин улучшает состояние скелетных мышц у MDX мышей (стр. 2 )

Иммуноокрашивание  и обнаружение  центральных ядер.

EDL сечения (10 мкм) с контрольной группы и получавшей АЦ  MDX мышей и подобранных по возрасту мышей дикого типа были использованы как для иммунного окрашивания дистрофина,  и визуализации центральных ядер. Подробности  процедуры были описаны ранее (Yeung соавт. 2005). Во-первых, поперечные сечения инкубировали

с AffiniPure Fab и Fc-фрагментами (Jackson ImmunoResearch лаборатории, West Grove, PA, США) в концентрации 60 мкг л в 2% БСА в течение 30 мин, затем промывали в фосфатно-солевом буфере (ФСБ ), а затем блокировали в

2% БСА в течение 15 мин. Ранее нами было показано, что эта процедура предотвращает неспецифическое связывание антимышиными вторичными антителами к эндогенным иммуноглобулинам мыши в срезе ткани. В качестве первичных антител были использованы мышиные моноклональные антитела против: кавеолина-3, разбавленного 1: 50 (BD Transduction Laboratories, США), ?-дистрогликана, разбавленного 1: 20 (NCL-би-DG, Novocastra лаборатории, Ньюкасл, Великобритания) и атрофина, разбавленого 1: 20 (NCL-Drp2, Novocastra Laboratories). Вторичные антитела были козьими антимышиными  конъюгированными  с Су3 антителами, разбавленными 1: 200 (Jackson ImmunoResearch Laboratories). Для обнаружения ядер вторичные антитела  содержали флуоресцентный окрашивающий ядра 4 ',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI, Sigma, Сент-Луис, штат Миссури, США), который был разбавлен 1: 100. Флуоресцентные изображения поперечных сечений были приняты с 5 ? или 20 ? (Zeiss плана Neola),  и количество мышечных волокон с центральными ядрами рассчитывали как процент от общего количества волокон с видимыми ядрами (т. е. оба центральных и периферических).

Окрашивание дигидроетидиумом на АФК.

Дигидроетидиум (ДГЭ) является широко используемым показателем продукции АФК как в пробирке (Benov соавт. 1998), так и в естественных условиях (Robinson и соавт. 2006). Он окисляется АФК, в частности супероксидом (О2-), образуя бромид этидия, который флуоресцирует красным (Benov соавт. 1998). Поэтому интенсивность флуоресценции  в ядрах клеток является мерой продукции АФК. АФК измеряли путем инкубации EDL сечений с 5 мкм ДГЭ в PBS при 37 ° С в течение 30 мин. ДГЭ интенсивность оценивали путем подсчета количества пикселей превышающий  заданный порог, который был создан с целью устранения помех от любой фоновой флуоресценции.

Вестерн-блоттинг.

Замороженные мышцы TA лизировались Polytron PT 1200 гомогенизатором (Kinematica, Littau / Люцерн, Швейцария) с использованием ледяного буфера для лизиса либо общего лизата или ядерной фракции. Для полного лизата мышцы лизировали в буфере, содержащем 50 мМ Трис, рН 7,5, 150 мм NaCl, 25 мМ ЭДТА, 25 мм EGTA, 1% Тритон Х-100, ингибитора протеазы, калпаин, ингибитора фосфатазы (Sigma) . Через 30 мин инкубации  гомогенаты центрифугировали при 15 800 g в течение 30 мин при 4 ° С, и супернатант удаляли. Для ядерных фракций два буфера были использованы. Во-первых, мышцы лизировали в буфере, содержащем 10 мМ Hepes, 1,5 мМ MgCl2, 10 мМ KCl, 0,5 мМ DTT, 0,05% NP40, протеазы, калпаина 1 и фосфатазного ингибитора. Мышечные лизаты хранили на льду в течение 10 мин и затем центрифугировали при 800g в течение 10 мин при 4 ° C. Надосадочную жидкость удаляли, а осадок, содержащий ядерные белки, затем ресуспендировали в буфер, используемый для общего лизата. Через 30 мин гомогенаты центрифугировали при 15 800 g в течение 30 мин при 4 ° С и супернатант удаляли. Концентрацию белка в надосадочной жидкости определяли с помощью анализа Брэдфорда (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).В общей сложности 20 мкг белка на лунку загружали в 4% (укладки) -12% (решить) полиакриламидном геле. Белки разделяли электрофорезом в ДСН-ПААГ и переносили на нитроцеллюлозную мембрану  с использованием мини Транс-блот передачи  (Bio-Rad). Мембраны блокировали в течение 30 мин при 5% обезжиренного сухого молока в PBS-Tween 20 при комнатной температуре. Для полного лизата мембраны инкубировали с первичными антителами против кавеолина-3,  разводили 1: 1000 в блокирующем буфере в течение 1 ч при комнатной температуре. Ядерные фракции  инкубировали с первичными антителами  к  NF-kB (p65 фосфо S276, Abcam, Cambridge, UK), разбавленными 1: 500 в блокирующем буфере в течение ночи при 4 ° С. После промывки PBS-T,  мембраны были инкубированы  в течение 1 ч при комнатной температуре с HRP-конъюгированными анти-мышинными (для кавеолином-3) или анти-кроличьими  (для NF-kB) вторичными антителами (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) в разведении 1: 1000. Мышиные моноклональные ?-актиновые антитела (Sigma) использовали в качестве контроля для обеспечения равной нагрузки.

Статистика

Все данные представлены как среднее значение ± S. E.M. Значительная разница между группами была определена с использованием критерия Стьюдента для непарных данных или двухфакторного дисперсионного анализа. Уровень значимости был установлен на уровне р <0,05.

Результаты

MDX мышцы обработанные АЦ  улучшают силу после сокращения.

Сокращения проводили при 35 ° С, а не при комнатной температуре, так как АФК в изолированных  скелетных мышцах, как известно, значительно возрастет в этом диапазоне температур (Arbogast и Reid, 2004). В предварительных экспериментах, мы обнаружили, что снижение силы мышц MDX от трех растянутых сокращений при 35 ° С было сопоставимо (~ 35%). Поэтому мы решили использовать три  сокращения в нынешней серии экспериментов. Как показано на рис. 1А, сила сокращения вызванного  растяжением было значительно больше в MDX мышцах, чем дикий тип. Через 60 мин после  сокращения (фиг. 1В), среднее усилие было 35 ± 3%  для мышц MDX контроля (n = 9), который был значительно меньше, чем у MDX мышц  с АЦ, где величина составила 51 ± 2% (Р <0,001, п = 11). Дикий тип мышц имел среднюю силу 69 ± 4% (n = 4), значительно больше, чем оба MDX  (Р <0,001). Для того, чтобы установить, что АЦ-индуцированная защита от стресс-индуцированной потери силы была присуща MDX мышцам, мы также провели несколько экспериментов с АЦ у  дикого типа мышц. АЦ не оказал существенного влияния на снижение силы мышей дикого типа (72 ± 1%, N = 6).

АЦ  предотвращает поглощение СКЭ в MDX мышцах  после сокращения.

Поступление в мышечные волокна СКЭ  было использовано для оценки повышенной проницаемости мембраны у MDX и дикого типа  мышц после сокращения. EDL мышцы были заморожены через 60 мин после растяжения, и сечений, взятые из середины мышцы живота, были использованы для количественного  анализа СКЭ. На рис. 2А,  сечения показывают, что MDX контрольные  мышцы имели значительно больше СКЭ-положительных волокон, чем дикий тип, в то время АЦ  предотвращает увеличение поглощения красителя в MDX мышцах. Когда данные были собраны (фиг.2В), мышцы MDX контроля имели  8,6 ± 1,8% (N = 8) СКЭ положительных волокон по сравнению с 1,8 ± 0,7% дикого типа мышц (п = 5, P <0,05) и до 2,6 ± 0,8% для MDX мышц АЦ (N = 7, р <0,05). Эти данные предполагают, что АФК способствуют наиболее повышенной проницаемости участка мембраны в MDX мышц при 35 ° С.

Лечение АЦ снижает содержание центральных ядер у MDX мышей

Регенерацию мышечных волокон  после периода некроза можно количественно определить  по наличию центральных ядер в сечениях мышц. В этих экспериментах MDX мышей обрабатывали 1% АЦ в питьевой воде от 3 до 9 недель - в  период наиболее обширного повреждения и регенерации. В сечении мышц  от MDX мышей  в возрасте 9 недель было большое количество волокон, содержащих центральные ядра, и  заметно меньше в  MDX мышцах мышей, получавших АЦ (фиг.3А). Среднее число  волокон с центральными ядрами составляло 70 ± 3%

для MDX мышц контроля (N = 6), и  было значительно сокращено до 46 ± 3% в MDX  получавших АЦ (N = 6, р <0,001, рис. 3В). Учитывая, что дикий тип мышц не имел центральных ядер (рис. 3), этот результат показывает, что в мышцах  MDX мышей, получавших АЦ, было примерно на одну треть меньше поврежденных волокон, чем у MDX мышей контроля.

Лечение АЦ  защищает от потери сил при сокращениях.

В эксперементах на  изолированных  мышцах (как описано ранее) АЦ обеспечивает защиту против  снижения силы MDX мышц. Таким образом, мы хотели исследовать  в естественных условиях,  может ли лечение АЦ  у мышей MDX также защищать от стресс-индуцированного повреждения. Первую серию экспериментов проводили при комнатной температуре. EDL мышцы изолированные  от  мышей всех групп прошли серию из четырех  сокращений с измерением  мышечной силы  через  60 мин. В это время средняя сила для  контрольных MDX мышц  составила 53 ± 2% от первоначального значения (п = 6), в то время как мышцы от  мышей, получавших лечение АЦ, имели значительно большую силу  60 ± 1% (п = 4, р <0,05 ). Во второй серии экспериментов при 35 ° С, силы  достоверно не различалась между  контролем  и леченными MDX  мышами (данные не показаны). Эти результаты показывают, что концентрация АЦ в мышцах мышей была достаточной для защиты от  индуцированных АФК при комнатной температуре, но не при 35 ° С, где АФК намного больше (см. обсуждение).

АЦ  предотвращает чрезмерную продукцию АФК в мышцах мышей MDX.

Для того, чтобы проверить, является ли лечение АЦ фактором  снижения уровня АФК в мышцах MDX, мы использовали АФК-чувствительный краситель - ДГЕ. EDL сечения инкубировали с 5 мкм ДГЕ при 37 ° С, и измеряли интенсивность флуоресценции выше указанного порога. Как показано на рис. 4А, MDX  мышцы контроля имели гораздо более широкое распространение и интенсивное окрашивание ядер, чем любые леченные MDX  или контроль дикого типа мышц. Также может быть видно, что самое яркое окрашивание в контрольных  мышцах MDX  происходит в плотно упакованных областях, которые будут соответствовать проникновению воспалительных клеток, так как эти клетки могут производить значительное количество АФК (Nguyen & Tidball, 2003). Как показано на рис. 4B, площадь  окрашивания в MDX мышцах  24,3 ± 4,4% (N = 9), которая  значительно меньше (Р <0,05) в леченных MDX мышцах (7,5 ± 4,4%, п = 6, P <0,05) и  контроле дикого типа  (3,8 ± 1,4%, п = 5, р <0,01).