N-ацетилцистеин улучшает состояние скелетных мышц у MDX мышей (стр. 1 )

N-ацетилцистеин улучшает состояние скелетных мышц у  MDX мышей.

Мышечная дистрофия Дюшенна (МДД) является наиболее распространенной и разрушительной формой мышечной дистрофии, с частотой 1 на каждые 3500 новорожденных мальчиков. Она характеризуется прогрессирующей дегенерацией мышц в результате текущих повреждений мышц и неполной регенерации. Это вызывает глубокую мышечную слабость и таким образом  люди часто оказываются в инвалидной коляске в возрасте 10-12 лет  и обычно умирают в результате дыхательной и / или сердечно-сосудистой недостаточности  примерно в 20 лет.  МДД вызвана Х-хромосомной мутацией приводящей к отсутствию белка дистрофина в мышцах (Hoffman и соавт. 1987). Дистрофин большой белок (427 кДа), который связывает цитоскелет с группой мембраносвязанных белков, дистрофин-ассоциированного гликопротеинового (ДГК) комплекса. ДГК, в свою очередь, связывается с внеклеточным матриксом и поэтому дистрофин составляет структурное звено между цитоскелетом и внеклеточным матриксом. Мыши MDX также не имеют дистрофина и являются наиболее широко используемой животной моделью МДД. Мышцы от мышей MDX проходят периоды мышечной дегенерации и регенерации, которая является самой обширной в возрасте около 3-8 недель. Хотя они имеют более мягкий фенотип, чем у пациентов с МДД, мыши MDX предоставили исследователям  гораздо большее понимание механизмов, которые вызывают дегенерацию мышц при МДД, и также играют ключевую роль в тестировании потенциальных терапевтических стратегий (Khurana & Davies, 2003). В последние годы  наша лаборатория была сосредоточена на классе  ионных каналов, известные как механочувствительные или  активированные каналы (ДЗО), которые как  мы показали, способствуют повреждению мышц у мышей MDX (Енг и др. 2005;.. Уайтхед и др. 2006a ). Это хорошо известно, что MDX мышцы более восприимчивы к повреждениям  при  растягивании - эксцентричном сокращении мышц, чем обычно (Petrof соавт. 1993). Мы обнаружили, что поступление кальция через ДЗО является важной причиной повреждения мышц, так как SAC блокаторы предотвращают рост внутриклеточного Ca 2 + и значительно улучшить силу после сокращения в растянутых мышцах MDX (Енг и др.. 2005). Совсем недавно мы также показали, что стрептомицин  понижает проницаемость мембран и улучшает мышечную силу у MDX мышей после  сокращений, как в изолированных мышцах, так  и в интактных мышцах у мышей, подвергнутых упражнениям на беговой дорожке  (Уайтхед и др.. 2006a). В скелетных мышцах, повышение внутриклеточного Ca 2 + может увеличить производство активных форм кислорода (АФК) в митохондриях  и НАДФН-оксидазы (Martins и соавт. 2008). АФК, такие как гидроксильные радикалы, также приводит к повышению проницаемости мембран в мышечных волокнах из-за повышенного внутриклеточного Ca2 +, скорее всего, через перекисное окисление липидов (вой и Publicover, 1990). Поэтому, стрес-индуцированный Ca2 + приток через ДЗО может усилить образование АФК, и увеличение проницаемости мембраны  в мышцах MDX.  АФК  постулируются в качестве возможной причины дистрофических повреждений мышц в течение ряда лет (Rando, 2002;. Уайтхед и др. 2006b; Tidball & Велинг-Henricks, 2007). Работы, проведенные Rando и его коллегами показали, что мышечные трубочки от MDX мышц гораздо более восприимчивы к индуцированной гибели клеток, чем дикий тип мышц (Rando соавт. 1998). Эта группа также показала, что у 3-недельных мышей MDX, возраст, когда нет явных признаков повреждения мышц, есть свидетельства окислительного стресса, как показали, повышенное содержание  продуктов окисления липидов и увеличение производства антиоксидантных ферментов (Disatnik ET Ал. 1998). Это важное открытие предположило, что увеличение производства АФК было основной особенностью дистрофических повреждений мышц. Другое АФК-опосредованное влияние на дистрофические мышцы увеличивает окисление белков, как у мышей MDX (Hauser и соавт. 1995) и у пациентов с МДД (Хайкок соавт. 1996), что может привести к широкому кругу вредного воздействия на сократительную функцию мышц (Smith & Reid, 2006).Еще одно свидетельство в поддержку окислительного стресса как причины дистрофической патофизиологии в  исследованиях in vivo, в которых MDX мыши, получавшие антиоксиданты, полученные из зеленого чая (Buetler соавт. 2002) или низкое содержание железа, что снижает гидроксильные радикалы (Борнман др. . 1998), показали, уменьшение признаков повреждений мышц. Недавнее исследование также показало, что синтетический аналог витамина Е, IRFI-042, который имеет сильные антиоксидантные свойства, улучшает MDX мышечную функцию и уменьшает активацию фактора транскрипции ядерного фактора kB (NF-kB), который может  активировать АФК (Мессина и соавт. 2006). NF-kB регулирует транскрипцию множества генов, но особое значение в дистрофических мышцах провоспалительных цитокинов, таких как ФНО-? (Hodgetts соавт. 2006) и матриксные металлопротеиназы (Hnia соавт. 2007), которые, как было показано вносят свой вклад в повреждение мышц. Кроме того Kumar & Boriek (2003) показали, что циклическое, пассивное растяжение диафрагмы MDX усиливает активацию NF-Кб, которая была ослаблена антиоксидантом N-ацетилцистеином (АЦ).В данной работе мы используем АЦ для изучения влияния АФК на повреждение мышц у MDX мышей. АЦ был выбран потому, что является эффективным антиоксидантом в скелетных мышцах. В изолированных препаратах мышц он защищает от сокращене-индуцированного окислительного стресса (Sandstrom соавт. 2006) и снижает усталость мышц (Smith & Reid, 2006). Кроме того, после перорального введения АЦ, как было показано, он ингибирует NF-kB активацию в ненагруженных мышцах мышей (Farid соавт. 2005) и задерживает усталость мышц у человека (McKenna и соавт. 2006). Здесь мы использовали два экспериментальных подхода: (1) растянутых сокращений изолированных MDX мышц с или без АЦ и (2) молодых мышей MDX, получавших  перорально АЦ в течение 6 недель. В частности, мы протестировали три основные гипотезы с помощью этих экспериментов. (1) Есть ли  у АФК способствовать снижать силу  мышц и повышать проницаемость мембран после сокращения в растянутых изолированных мышцах  MDX? (2) Может ли АЦ  снижать внутриклеточный уровень АФК и обеспечивает защиту от повреждения мышц MDX в естественных условиях? (3) Может ли лечение АЦ  снижать  NF-kB активацию и регулировать экспрессию ключевых белков сарколеммы, ассоциированных с комплексом дистрофина?

Методика

Животные

Особи мужского пола MDX и дикого типа (C57 BL/10 ScSn) мышей в 3 или 8-недельном возрасте были поставлены  Центром,, WA, Австралия. Эксперименты были одобрены Комитетом  по использованию животных  из Университета Сиднея.

Эксперименты на изолированных мышцах.

Мыши были убиты подкожной инъекцией пентобарбитала натрия (163 мг кг-1). Мышцы разгибателя пальцев (EDL)  иссекают  в возрасте  8 -  10 недель. Алюминиевые клипы были прикреплены к сухожилиям на обоих концах мышц. Мышцу помещали в камеру из плексигласа и  клипы были расположены на металлических крючках, которые были прикреплены к датчику силы и рычагу  двигателя (модель 300B-LC, Аврора Научно Инк, Онтарио, Канада ). Два платиновых электрода расположили  параллельно мышцам при условии стимуляции. Мышцы перфузировали стандартным раствором, содержащим (мм): NaCl (121), KCl (5), CaCl2 (1,8), MgCl 2 (0,5), NaH2PO4 (0,4), NaHCO3 (24) и глюкозу (5,5). Раствор постоянно продувают 95% O2 и 5% CO2 (рН 7,4). Эксперименты проводились  при комнатной температуре (~ 22 ° C) и 35 ° С, как описано ниже.

Сокращения изолированных мышц.

В этих экспериментах, мышцы подвергали перфузии с любым стандартным контрольным раствором или стандартным раствором, содержащим 20 мм N-ацетилцистеина (АЦ). Эта концентрация АЦ, как ранее было показано,  мало влияет на изометрическую силу, возникающую в скелетных мышцах (Khawli & Reid, 1994). Первоначально, мышца была стимулирована два или три раза при 120 Гц, чтобы определить супрамаксимальное напряжение, а затем отдыхали в течение 30 мин при комнатной температуре. Отношение длины натяжения к максимальному спазму было определено путем стимулирования мышц (120 Гц, 300 мс) с 60-секундными интервалами. Мышцы затем установили на ее оптимальную длину (Lo). В это время, 0,02% (вес / объем) синий краситель Эванса (СКЭ) и 0,5% бычьего сывороточного альбумина (БСА) добавляли к перфузату, с или без АЦ, до конца эксперимента. СКЭ представляет собой мембранно-проницаемый флуоресцентный краситель, и это широко используемый маркер мембранных сбоев в скелетных мышцах (Hamer и соавт. 2002). Единичное тетаническое сокращение  проводили через 30 мин после  измерения напряжения, для того, чтобы подтвердить, что подготовка была стабильной. Температура камеры затем повышалась до 35 ° С. Это было достигнуто путем нагревания раствора на водяной бане, и направляя его через специально разработанный алюминиевый теплообменник, что обеспечило постоянную температуру в камере. Через 1 мин при 35 ° С мышцы подвергали трем растяжениям через  30 сек друг от друга. Каждое сокращение  составляет 300 мс спазмов  от Lo  + 30%,  с 150 мс после начала стимуляции и  в течение 100 мс (скорость растяжения, 3 ? Lo S-1). Через 60 минут после того как провели растяжение,  длину натяжения  снова измеряли и определяли максимальную изометрическую силу. Мышца была заморожена в изопентане охлажденном в жидком азоте, и хранили при -80 ° С. Замороженные EDL сечения (10 мкм) помещали на  L-лизин покрытых слайдах, фиксировали в ледяном метаноле (-22 ° С) в течение 5 мин, а затем сушили на воздухе при комнатной температуре (~ 22-25 ° С) . Для количественной оценки поглощение СКЭ в мышечных волокнах, секции рассматривались под флуоресцентным микроскопом (Zeiss Axioplan 2), при  диапазоне 545/30 нм и 570 нм  нижних частот. Цифровые изображения были захвачены  ПЗС-камерой, прикрепленой к микроскопу (Zeiss AxioCam HRM). Все разделы были обследованы с использованием идентичных оптических параметров. СКЭ положительные мышечные волокна с интенсивностью флуоресценции, которая превысила заданный порог, были включены в анализ. Площадь СКЭ положительных волокон рассчитывали как процент от всей  площади  поперечного сечения мышцы. Для экспериментов в естественных условиях MDX мыши в возрасте 3 недель были разделены на две группы контрольных мышей, получавших обычную питьевую воду (кон) и обработанных мышей, получающих питьевую воду, содержащую 1% (~ 60 мм) N-ацетилцистеин (АЦ) (Farid др. Ал. 2005). После 6 недель лечения (9 недель) мышей забивали, и EDL и передняя большеберцовая (TA) мышцы были удалены. EDL мышцы были установлены в Tissue-Tek и замораживали в изопентане охлаждаенной в жидком азоте. TA мышцы быстро замораживали в жидком азоте.