Учебно-методический комплекс дисциплины «анализ природных объектов» для специальности 5В060800 — «Экология» (стр. 7 )

Для этого на стерильное часовое стекло стерильным фарфоровым шпателем или алюминиевой чайной лож­кой берут из банки навеску почвы 1 г. Предварительно почву в банке тщательно перемешивают. Ложку и ча­совое стекло обжигают в пламени горелки. Чтобы при взвешивании почвы в нее не попали из воздуха бакте­рии, часовое стекло накрывают другим часовым стек­лом.

Навеску почвы, соблюдая условия асептики, перено­сят в колбу на 250 мл с 99 мл стерильной водопровод­ной воды. Смесь взбалтывают в течение 5 мин, не сма­чивая пробку. Стерильной пипеткой берут 1 мл суспен­зии, содержащей 10~2 г почвы, и переносят в пробирку с 9 мл стерильной водопроводной воды. Пипетку неод­нократно промывают водой из пробирки, чтобы макси­мально смыть клетки со стенок пипетки, и отставляют. Другой стерильной пипеткой берут из колбы еще 1 мл суспензии и помещают во вторую колбу, тоже содержа­щую 99 мл стерильной водопроводной воды, пипетку так же промывают и отставляют. Пробирку и вторую колбу взбалтывают 1 мин. В пробирке в 1 мл концен­трация 10~3 г, а во второй колбе—КН г. Точно так же переносят стерильными пипетками по 1 мл суспензии из второй колбы во вторую пробирку с 9 мл и в третью колбу с 99 мл стерильной водопроводной воды, готовят суспензии, содержащие соответственно в 1 мл 10~5 и 10~6 г почвы.

Для определения численности бактерий методом пи­тательных пластин можно провести глубинный или по­верхностный посев. Поверхностный посев более сложен и занимает больше времени. Поэтому для усвоения принципа подсчета численности бактерий методом пи­тательных пластин на первых порах ограничимся про­ведением глубинного посева. Поверхностный посев бу­дет использован при проведении общего микробиологи­ческого анализа почвы.

Чтобы определить, сколько клеток содержится в 1 мл суспензии каждого разведения, отдельными сте­рильными пипетками берут 1 мл суспензии из соответ­ствующего разведения и переносят в стерильные чаши Петри. На крышке чашки восковым карандашом отме­чают разведения. Затем в каждую чашку с суспензией вливают расплавленный столбик мясопептонного ага­ра, заранее приготовленный и разлитый в пробирки (2/з объема их) из расчета один столбик на чашку. Тем­пература расплавленного агара должна быть примерно 45°С Ее устанавливают следующим образом: пробирку с расплавленным агаром прикладывают к щеке, если щека выдерживает температуру, столбик агара можно вылить в чашку Петри, Осторожным круговым враще­нием чашки агар перемешивают с суспензией. Чашки с застывшим агаром переворачивают вверх дном (что­бы избежать попадания на поверхность агара конденса­ционной воды с крышки), и помещают в термостат при 28—30°С

Клетки микроорганизмов, попав в питательную сре­ду, начинают размножаться и образуют колонии, види­мые невооруженным глазом. Через 48 ч инкубации чаш­ки вынимают из термостата и в них подсчитывают чис­ло колоний. Окончательно подсчитывают колонии на 5-е сутки.

Чтобы подсчитать число бактерий в 1 г сырой поч­вы, число колоний на чашке умножают на степень раз­ведения (число, показывающее, во сколько раз в каж­дом конкретном случае разбавили 1 г почвы). При умножении числа колоний на степень разведения во всех случаях, казалось бы, должно получиться примерно одинаковое число зародышей в 1 г почвы. Однако прак­тически это не совсем так.

Иногда может оказаться так много клеток, что при развитии микроорганизмов колонии сольются; это часто наблюдается в чашках при разведении 10~2. Редко в чашках с суспензией из высоких разведений вырастают единичные колонии (меньше десяти), которые могут образоваться от случайно попавших клеток из воздуха. Поэтому при подсчете цифры могут сильно отклоняться, и результат будет недостоверным. Для правильного уче­та подсчитывают только такие чашки, в которых коло­ний свыше десяти и не более 200 (в последнем случае при условии, если колонии мелкие). г Чашки просматривают в проходящем свете, и, что­бы дважды не подсчитывать одни и те же колонии, их отмечают чернилами или тушью. Чтобы не упустить мелкоточечные колонии, чашки дополнительно просматривают с лупой. Можно использовать специальный при­бор для подсчета колоний.

В лабораторной практике встречаются случаи, когда в последнем разведении (10-6) число колоний значи­тельно - больше 200. В этих случаях посев желательно повторить, увеличив число разведений. Если, однако; новый посев осуществить невозможно, чашки подсчиты­вают, но исследователь может получить представление лишь о минимальном количестве микроорганизмов в почве. Для подсчета большого числа колоний (более 200) используют счетную камеру Вольфюгеля. Перевернутые вверх дном чашки Петри помещают на подставку камеры и накрывают стеклянной пластинкой, на которой нанесены квадратные сантиметры или более мелкие единицы. Число колоний подсчитывают в разных местах чашки в. 20—25 квадратах, выводят среднее арифметическое на 1 см и делают пересчет на общую площадь чашки, равную площади круга.

Метод питательных пластин легко выполним, но име­ет ряд недостатков. Существенным из них является от­сутствие универсальной среды, на которой развивались бы все бактериальные зародыши, обитающие в почве. Питание у бактерий специфично, и на каждой среде выявляется довольно узкая группа микроорганизмов. Так, на МПА развиваются в основном бактерии, способные усваивать органические формы азота. Нитрифи­цирующие, целлюлозоразрушающие, азотфиксирующие и другие микробы на этой среде не выявляются. Для более полного представлений о населенности почвы делают посевы также и на специальные избирательные среды или используют метод прямого подсчета микроорганизмов под микроскопом.

При методе питательных пластин возможен и не­полный учет клеток в образце в связи с тем, что в од­ном месте на агаре может застыть не одна, а несколько клеток. Изолированные на агаре в одном месте клетки размножаются, их колонии сливаются, создавая впечат­ление только одной.

Частично можно внести поправку в счет колоний. Для этого из колонии с неоднородным характером ро­ста готовят окрашенный препарат. Если под микроско­пом обнаружатся разные формы (кокки, палочки, сар­дины), то вносят поправку и колонию считают не за одну, а за три. Если же все клетки одинаковые, то счи­тают, что колония произошла от одной клетки, хотя в этом месте одинаковых клеток могло быть 5, 10 и больше.

Для сравнения численности бактерий в разных поч­вах необходимо подсчитать их количество на 1 г абсо­лютно сухой почвы. С этой целью одновременно со взя­тием навески почвы для приготовления разведений в от­дельный металлический или стеклянный бюкс берут навеску почвы (5—10 г) для определения влажности ее. Сушат почву при 105°С до постоянной массы. Затем число клеток в 1 г сырой почвы надо разделить на на­веску абсолютно сухой почвы, содержащейся в 1 г сы­рой почвы.

Пример. В 1 г сырой почвы содержится 5600 клеток. При влажности почвы 30% это число клеток будет соответствовать 0,7 г абсолютно сухой почвы. Для определения численности клеток в 1 г абсолютно сухой почвы составляют пропорцию: 0,7 г —5600        х =8000.

Лекция № 5. Методы анализа воздуха.

Особенности и методы анализа воздуха. Хроматографические методы:

А) Жидкостная и высокоэффективная жидкостная хроматография.

Б) Абсорбционная хроматография.

В) Газовая хроматография.

1.

Хроматография в настоящее время является наиболее широко используемым методом исследования объектов окружающей среды.

Хроматографический метод был предложен в 1903 году русским ученым . Он писал: «При фильтрации смешанного раствора через столб адсорбента пигменты... расслаиваются в виде отдельных, различно окрашенных зон. Подобно световым лучам в спектре, различные компоненты сложного пигмента закономерно распределяются друг за другом в столбе адсорбента и становятся доступными качественному определению. Такой расцвеченный препарат я назвал хроматограммой, а соответствующий метод анализа хроматографическим методом. Цвета послужили фундаментом для развития остальных видов хроматографии для разделения как окрашенных, так и неокрашенных соединений, осуществляемых в любых средах.

Хроматография - это метод разделения и определения веществ, основанный на распределении компонентов между двумя фазами: подвижной и неподвижной. Неподвижной (стационарной) фазой служит твердое пористое вещество (часто его называют сорбентом) или пленка жидкости, нанесенная на твердое вещество. Подвижная фаза представляет собой жидкость или газ, протекающий через неподвижную фазу, иногда под давлением.

Компоненты анализируемой смеси (сорбаты) вместе с подвижной фазой передвигаются вдоль стационарной фазы. Ее обычно помещают в стеклянную или металлическую трубку, называемую колонкой. В зависимости от силы взаимодействия с поверхностью сорбента (за счет адсорбции или по какому-либо другому механизму) компоненты будут перемещаться вдоль колонки с разной скоростью. Одни компоненты останутся в верхнем слое сорбента, другие, в меньшей степени, взаимодействующие с сорбентом, окажутся в нижней части колонки, а некоторые и вовсе покинут колонку вместе с подвижной фазой (такие компоненты называются неудерживаемыми, а время их удерживания определяет "мертвое время" колонки).

Таким образом происходит быстрое разделение сложных смесей компонентов. Следует подчеркнуть следующие достоинства хроматографических методов:

1.        Разделение носит динамический характер, причем акты сорбции-
десорбции разделяемых компонентов повторяются многократно. Этим обусловлена значительно большая эффективность хроматографического разделения  по  сравнению  со  статическими  методами  сорбции  и экстракции.

2.        При разделении используют различные типы взаимодействия сорбатов и неподвижной фазы: от чисто физических до хемосорбционных. Это обуславливает возможность селективного разделения широкого круга веществ.

3.        На  разделяемые  вещества  можно  накладывать  различные дополнительные поля (гравитационное, электрическое, магнитное и др.), которые,  изменяя условия  разделения,  расширяют  возможности хроматографии.