Бигликан регулирует экспрессию и сарколемную локализацию дистробревина, синтрофина и NО (стр. 1 )

Бигликан регулирует экспрессию и сарколемную локализацию дистробревина, синтрофина и NО.

Белковый комплекс дистрофина  ( БКД ) обеспечивает важнейшую связь между базальной мембраной и цитоскелетом в скелетных мышцах. Он состоит из трех подкомплексов : дистрофин и дистрогликаны ( б - , в - ); саркогликаны ( б - , в - , г - д - ) – саркоспан; и цитозольный дистробревин –синтрофин-NО (1, 2). Дистрофин связывает актин и цитоплазматический хвост в - дистрогликана. б - дистрогликан в свою очередь соединяется с в - дистрогликаном с  ламинином, агрином, перлеканом и бигликаном (2, 3). Поддержание связи  важно для поддержания функции скелетных мышц и их стабильности. На клеточном уровне  мутации в генах кодирующих белков DAPC вызывают дестабилизацию DAPC, потерю целостности мембраны, и дегенерацию мышечных волокон ( 4 , 5). Ранее мы показали, что молекула ECM бигликан экспрессируется на поверхности скелетных мышц  и связывается с белком DAPC б - дистрогликаном (3). Бигликан является членом семьи небольших лейцин - богатых  протеогликанов ( SLRP ). Оно содержит в своей последовательности 38 кДа полипептид  с  10 лейциновыми  повторами в окружении двумя богатыми цистеином доменами и двух участков гликозаминогликана ( ГАГ)  на его  NH2 - конце. Бигликан - дефицитные мыши, как было показано, снизили темпы роста, а также наблюдалось снижение костной массы ( впервые обнаружено в возрасте 6 мес ) и преждевременный остеоартрит ( 6, 7). Мышцы экспрессируют и  " протеогликан " (PG)  и полипептидное "ядро". Бигликан, как  было показано, играет роль в развитии скелетных мышц и регенерации. Это  повышает регуляцию во время регенерации мышечных волокон, и мыши с дефицитом бигликана имеют  задержку регенерации после травмы (8). Кроме того, мыши, сверхэкспрессирующие бигликан, продемонстрировали развитие аберрантных  мышц (9). Тем не менее, не известно, как внеклеточный бигликан влияет на процессы, которые влияют на сигнализацию внутри мышечной клетки и как бигликан влияет на состав DAPC. Здесь мы показываем, что взрослые мыши с отсутствием бигликана проявляют мягкий дистрофический фенотип, показывая увеличение дегенерации и регенерации мышечных волокон, ненормальное распределение размеров волокон и слабость мышечной оболочки. Исследование DAPC элементов показало селективное снижение локализации б - дистробревина -1 и -2 , б - и в1 – синтрофина  и NО в сарколемме. Экзогенный бигликан побудил перелокализация нОАС из  цитозоля в плазматическую мембрану в культуре бигликан-дефицитных мышечных клеток. Наконец, внутримышечные (IM ) инъекции рекомбинантного бигликана восстановило экспрессию б – дистробревина -1, б - дистробревина -2 и в1 –синтрофина в сарколемме бигликан нулевых мышей. Таким образом, бигликан важен для поддержания целостности мышечных клеток и играет непосредственную роль в регуляции экспрессии и сарколемной локализации внутриклеточного DAPC  б - дистробревина - 1 и -2 , б - и в1 - синтрофина и NО сигнализации.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Экспрессия и очистка рекомбинантного бигликана.

Рекомбинантный бигликан был произведен с использованием стабильной трансфекции в  линию 293- EBNA клеток. Клеточная линия была создана путем передачи бигликана полигистидином слитой конструкции, первоначально созданного для экспрессии с использованием системы экспрессии вируса осповакцины в рСЕР4 (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, США) вектор экспрессии. Полученную в результате плазмиду трансфицировали в 293- EBNA клетки и отобрали устойчивые клетки при культивировании в присутствии гигромицина В. После амплификации клетки высевали в биореакторе Celligen Plus (New Brunswick Scientific, Edison, NJ, США) , содержащем 100 г Fibra – Cel с возрастанием  до насыщения. Продуцирование белка было инициировано путем замены культуральной среды в  модифицированной Дульбекко среде без сыворотки Дульбекко ( DMEM ) . После концентрации кондиционированной среды с помощью тангенциальной проточной системы Pellicon 2 ( Millipore Corporation, Bedford, MA, США), рекомбинантный бигликан очищали с использованием никелевой хелатирующей хроматографии и элюированием градиентом 0-250 мМ имидазола в 20 мМ Трис-HCl, 500 мМ NaCl, 0,2% CHAPS, рН 8,0 . Полипептид бигликана  с " протеогликаном" и с "основными" глюкохаминогликанами  затем отделяли от протеогликана после анионообменной хроматографии  и элюции с линейным градиентом 0.15-2 М NaCl в ЗФР ​​, 0,2% CHAPS. Следует отметить, что обе формы N - гликозилированные (10).

Антитела.

Были использованы следующие первичные антитела : анти - бигликан (клоны 2A5 и 4C6 ) ( Creely др. , неопубликованные результаты. ), анти - дистробревин (BD Transduction Laboratories) ( Сан-Хосе, Калифорния, США), изоформы конкретных  антител к синтрофину  SYN259 ( б - syntrophin ) , SYN29 ( в2 - syntrophin ) и SYN37 ( в1 - syntrophin ) (11) ⇓ ,  антитела к дистробревину 638 ( б - dystrobrevin - 1) , и DB2 ( б - dystrobrevin -2 ) (12) ⇓ , анти - NО ( Immunostar, Хадсон, Висконсин, США) , анти -6- 10  дистрофин ( щедрый подарок от Тимоти Дж. Байерс и Луис M. Kunkel ( Гарвардской медицинской школа  детской больници, Бостон, Массачусетс, США ) , анти - меросин ( Alexis Biochemicals, Сан-Диего, Калифорния, США ) и NCL - dys2 ( дистрофин ), NCL - г - SARC ( г - саркогликана ) , NCL - б - SARC ( в - саркогликана ) и NCL - а - SARC ( б - саркогликана ) ( Novocastra, Ньюкасл на Тайн, Великобритания ).

Были использованы следующие вторичные антитела : . Alexa 488 - козы против IgG кролика, Alexa 488 - антимышиный IgG (Molecular Probes, Eugene, OR, США ) , Cy3 - козьи антитела против кроличьего IgG ( Jackson Immunoresearch, West Grove, PA, USA) козьи антитела с пероксидазой хрена против кроличьего IgG, и козьи антитела с пероксидазой хрена против мышиных IgG (Amersham, Piscataway, NJ, USA).

Производство антител к  бигликану ( Ab ).

Моноклональные антитела, способные обнаруживать бигликан иммуногистохимически, были произведены. Взрослым  бигликан-дефицитным мышам вводили вакцины virus/T7 бактериофага экспрессирюющие ядро и протеогликаны форм бигликана  (Sigma, Сент-Луис, Миссури, США ) . Проводились шесть повторных инъекций. Гибридома, секретирующая антитела, которые окрашивали дикий тип, срезы  не бигликан - дефицитных мышц считались положительным и субклонировали. Моноклональные антитела 2A5 и 4C6 были использованы в настоящем исследовании.

Мембранные препараты скелетных мышц.

Четырехглавую мышцу  5- WK - старых мышей гомогенизировали в буфере, содержащем  0,3 М сахарозы, 35 мМ Трис (рН 7,4) , 10 мМ ЭДТА, 10 мМ EGTA, коктейль ингибиторов протеаз (Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA) , и азид натрия. Образцы обрабатывают ультразвуком на льду в течение 3 Ч 10 с и центрифугируют при 7000 г при 4 ° С в течение 20 мин. Твердый KCl был добавлен до конечной концентрации 0,6 М и образцы центрифугировали 7000 г в течение 20 мин. Мембраны затем собирают центрифугированием в течение 140 000 г в течение 60 мин при 4 ° С. Концентрация белка определяется бицинхониновой кислотой ( Pierce, Rockford, IL, США).

Вестерн-блот анализ.

Белки были переведены  на нитроцеллюлозные мембраны в буфере для переноса при 100 V в течение 1 ч при 4 ° С. Мембраны блокировали  TBS, 0,1% Твин-20 , 4,0 % нормальной козьей сывороткой, 5,0 % молоке в течение 1 ч при комнатной температуре и инкубировали с первичным Ab в блокирующем буфере в течение ночи при 4 ° С. Мембраны промывали и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре с козьим анти - кроличьими или анти - IgG мышинными  конъюгированными с пероксидазой хрена ( Amersham Biosciences ), разбавленными 1:1000 в блокирующем буфере. После промывки граница Ab была обнаружена с помощью усиленной хемилюминесценции в соответствии с протоколом производителя ( Amersham ).

Бигликан нулевые мыши.

У бигликан-дефицитных  мышей  были получены путем вставки PGK - нео кассеты из вектора ООПТ в экзоне 2 на месте Tth111I как описано (6). Оригинальные C57BL / 6 фоновые мыши скрешивали,  а затем обратно скрещивали с C3h на протяжении нескольких поколений, чтобы создать конгенных животных (14)  и были получены от Jackson Labs ( Bar Harbor, ME, США) . Аналогичные результаты наблюдались в обоих возрастах. ( В предварительных экспериментах мы наблюдали, что дикий тип и бигликан нулевые мыши  C57BL / 6  дали результаты неотличимые от  фоновых животных. ) Животных содержали при комнатной температуре с 24 ч - дневным циклом и кормили гранулами и  водой. Все протоколы были проведены в строгом соответствии  с официальным одобрением Комитета институциональному уходу и использованию животных университета Брауна.

Количественный анализ полимеразной цепной реакции ( ПЦР).

Выделение РНК из р35 четырехглавой мышцы проводили с использованием метода тризола ( Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, Карлсбад, Калифорния, США). Очищенную РНК превращали в кДНК с использованием набора Superscript III First - Strand Synthesis System (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). КПЦР реакцию проводили с использованием SYBR - зеленого метода (Invitrogen) на ABI PRISM 7300 в режиме реального времени. Грунтовки были разработаны с использованием DS Gene праймера разработки программного обеспечения ( Accelrys, Сан-Диего, Калифорния, США) . АТФ-синтаза была использована для

нормализации. Анализ данных проводили с использованием стандартного метода кривой (15). Все эксперименты проводились в трех экземплярах с помощью трех пар мышей дикого типа и бигликан нулевых. Используемые праймеры: 5'- TGG ГАА ААТ CGG ACT СТТ ТГ - 3 ' ;  5'- АГТ AAC CAC хлорамфеникол ацетилтрансфераза (КПП) GGG СТТ ТГ - 3 ' ; б - синтрофин, 5'- AAG CTG AGG ATC GTT CAT C -3 ' ; б - синтрофин  5'- TCA GGC TGG TCT КТГ АГ-3 '; в1 - синтрофин, 5'- ГАА CAG AGA GGC ПКК ТТГ CC -3 ' ; в1 - синтрофин 5'- хлорамфеникола ацетилтрансфераза ГТГ ACT ССТ ТАА ацетил - коферментакарбоксилаза (АКК) ТГ - 3 ' ; в2 - синтрофин 5'- GCA АСА АСА AAG AAG С - 3 ' ; в2 - синтрофин 5'CCT GTT ГТГ GTC CAG CAG ТГ - 3 ' ; б - дистробревин -1, 5'- TGA AGA АСА CAG GCT GAT CG - 3 ' ; б - дистробревин -1: 5'- GCA TCG ATG ГТГ AAG ГАГ АТ-3 '; б - дистробревин - 2 вперед, 5'- ССТ СТТ GTC ТТГ TTC ССТ ГТГ - 3 ' ; б - дистробревин -2 Реверс: 5'- CAG CGC ССТ ААА AAC AGA AA - 3 ' ; ННО вперед, 5'- GGG CAA АСА GTC TCC TAC СА-3 '; ННО обратно : 5'- AGG ГТГ TCA ГТГ AGG ACC AC - 3 ' .