Экстракт зеленого чая и его основной полифенол (-)-эпигаллокатехин галлат улучшают мышечную функцию у мышиной модели мышечной дистрофии Дюшенна (стр. 1 )

Экстракт зеленого чая и его основной полифенол (-)-эпигаллокатехин галлат улучшают мышечную функцию у мышиной модели мышечной дистрофии Дюшенна

Мышечная дистрофия Дюшенна (МДД) является тяжелой мышечной дистрофией, которая возникает  у мальчиков  (1:3500 новорожденных мальчиков). Заболевание характеризуется прогрессирующей атрофией мышц, начиная с раннего детства. Пациенты обычно умирают в возрасте 30, когда болезнь поражает сердечную и дыхательные мышцы. МДД возникает  из-за мутации в гене дистрофина, что приводит к полному отсутствию соответствующего белка. Дистрофин - большой белок цитоскелета, расположенный на внутренней поверхности плазматической мембраны в обычных волокнах скелетных мышц. Он  связывается как с ассоциированным с мембраной гликопротеиновым комплексом, так  и F-актин сетью, позволяя образование  непрерывности между внеклеточным пространством и внутриклеточным пространством мышечных клеток (для обзора см.. 6). Предполагается, что это обеспечивает защиту мышечных волокон от механического напряжения, вызванного сократительной активностью (32). Помимо  устоявшейся структурной функции,  недавно выяснилось, что  дистрофин участвует не только в архитектуре  мышечной клетки, но  и сигнализации. Соответственно, дистрофические состояние связано с широким разнообразием клеточных нарушений, которые включают мембранную нестабильность, нарушение регуляции Ca2 + гомеостаза, повышенную восприимчивость к окислительному стрессу, повышение протеолитической активности, нарушение метаболизма энергии (6). В целом, эти вредные события приводят к гибели мышечных волокон, с последующей активацией процессов самовосстановления. Активированные клетки иммунной системы, в основном, макрофаги и лимфоциты, проникают в места некроза и непрерывно выпускают активные формы кислорода, что приводит к дальнейшему повреждению окружающей мышечной ткани (33, 38). В ходе дистрофических процессов  регенеративная способность мышц истощается и приводит к замене функциональной мышечной массы  фиброзной и жировой тканью. После идентификации и характеристики гена дистрофина почти 20 лет назад, значительные усилия  сделаны, чтобы заменить или исправить мутировавший ген дистрофина с помощью гена или клеточной терапии (29). Однако эти подходы еще не привели к разработке терапии этого заболевания, в основном из-за вопросов, касающихся безопасности и ограничения векторов, ориентированных на все мышцы тела. До настоящего времени использовались  только процедуры, которые улучшают продолжительность  и качество жизни пациентов с МДД; они состоят из  кинезитерапии, вентиляционной помощи и фармакологических вмешательств. В настоящее время единственным препаратом, предложенным для пациентов с МДД, являются глюкокортикоиды: преднизолон и дефлазакорт (25). Их действие на воспаление, экспрессия  специфических для мышц  генов, коррекция нарушениия регуляции Ca гомеостаза  (22, 24), и активация кальциневрина / ядерного фактора активированных Т-клеток (NF-AT) пути (40) может объяснить их терапевтический эффект. Тем не менее, в некоторых случаях  МДД пациенты, получавшие стероиды, могут страдать от побочных эффектов, присущих этому классу молекул. Кроме того, терапевтический эффект по улучшению продолжительности жизни и качества жизни пациентов с МДД не общепризнан (25). Таким образом, в настоящее время соединения, используемые в терапии,  не удовлетворяют потребность. Следовательно, увеличение спектра препаратов для паллиативного лечения пациентов с МДД  представляет серьезную  проблему (15, 20). Текущие клинические испытания оценки потенциала различных соединений коррекции  некоторых нарушений, упомянуты выше. Они включают иммуносупрессивные и противовоспалительные средства, такие как циклоспорин A (11) или пентоксифиллин (PTX) для блокирования  проникновения активированных лимфоцитов,  средства защиты митохондрий, чтобы предотвратить апоптоз, креатин улучшает баланс мышечной энергии и помогает правильной регуляции кальция (23, 31), или антиоксиданты, противодействующие окислительному повреждению (8, 15).Что касается антиоксидантной терапии, экстракт зеленого чая (ГТЕ) представляется перспективным кандидатом. Зеленый чай является первым напитком по потреблению во всем мире. Он очень популярен в Азии, где он был известен на протяжении веков как здоровый напиток. Зеленый чай был  интенсивно  изучен за последние 20 лет в связи со  своими целебными свойствами (16, 27). Они включают его потенциал в качестве антиоксиданта (16, 28), противоопухолевые свойства (7), противовоспалительное (12), антибактериальное противовирусное (13)  действие (4), антифиброзные (49), гиполипидемические (48), или кардиопротекторные свойства (34) . Кроме того, зеленый чай, как было показано,  защишает мозг (17, 41) и сердце (3, 45) от повреждений при ишемии-реперфузии. Наконец, он модулирует клеточный поток  Ca2 +  (19). ГТЕ относится к горячей водорастворимой фракции  листьев зеленого чая. Ее основными компонентами являются катехин полифенолы, но он также содержит теафлавин, витамины, аминокислоты, и кофеин. Среди полифенолов (-)-эпигаллокатехин галлат (ЭГКГ) является наиболее распространенным, на него приходится 30-50% общих полифенолов, и известно, что  он обуславливает наиболее полезные свойства, связанные с потреблением зеленого чая (7, 16, 46). Мы уже сообщали ранее (8), что ГТЕ снижает некроз в разгибателе пальцев (EDL) у  мышей MDX, наиболее часто используемой животной модели МДД. В настоящем исследовании, дистрофические мыши  штамма mdx5Cv (18) получили  две дозы кофеина ГТЕ или дозу чистого ЭГКГ. С помощью гистологического исследования мышц ног и функциональной записи трицепса голени, мы обнаружили, что ЭГКГ  ГТЕ  защищают  мышцы задних конечностей  мышей  от  дистрофии и  массивного некроза, и значительно улучшают мышечную силу и сопротивление усталости.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Тестируемые соединения и пищевые гранулы.

Полифенолы без фракции  кофеина, обогащенные ГТЕ (Sunphenon DCF-1) были своего рода подарком от Taiyo Kagaku (Yokkaichi, Япония). ГТЕ состояла из 90% полифенолов, и остаточного кофеина 0,07%. Исходя из  общих полифенолов или общих катехинов,  содержание ЭГКГ составило 34,7%, или на 47,8%, соответственно. ЭГКГ (чистота> 99,9%) был приобретен у Yixin  (Чжэцзян, Китай). ГТЕ, ЭГКГ были включены в стандартную еду грызунов по-Kliba Nafag (Kaiseraugst, Швейцария). Рацион контрольной группы состоял из стандартной еды грызунов без добавления вещества.

Животные и лечение.

Исследование было проведено на мышах  mdx5Cv (18) и соответствующих им генетически нормальным аналогам, C57BL/6J мышам. Дистрофические животные mdx5Cv были любезно предоставлены доктором Серж Браун (трансгенные, Страсбург, Франция) с согласия лаборатории Джексона (Bar Harbor, ME). C57BL/6J мышей изначально приобретены у Charles River (Iffa Credo, Франция). Колонии впоследствии жили  в нашем виварии. Животных содержали в пластиковых клетках Поддерживался  цикл  12:12 ч-свет-темнота,  свободный доступ к пище и воде на протяжении всего исследования. Все процедуры, связанные с животными были проведены в соответствии с руководящими принципами швейцарского Федерального ветеринарного бюро,  на  основании Швейцарского федерального закона о защите животных, и были одобрены Кантональная ветеринарной службой. Группы были собраны из помета 3-WK-старых животных. В большинстве случаев два помета получили тот же рацион,  что каждая группа, наконец, содержащихся 7-10 животных. Mdx5Cv мышей начинали кормить при отъеме на 1 - 5 неделе обычным  кормом (именуемый как "необработанной" группа), или  кормом содержащим ГТЕ (0,05% и 0,25% вес / вес) или ЭГКГ (0,1% вес / вес). На основании исследования Granchelli соавт. (15), ПTК (0,1% вес / вес) была выбрана в качестве положительного контроля. Группа нормальных C57BL/6J мышей, получавших контрольный корм была также включена для сравнения.

Вес мышей и потребление пищи.

Мышей взвешивают дважды в неделю. Потребление продуктов питания контролировали только для животных изучаемых  с  5-недельного периода. Потребление пищи рассчитывают как массу потребляемых  гранул  на грамм веса тела в день. Расчет был основан на  вес мыши в конце каждой недели лечения.

Изометрическая сила.

В конце периода лечения животных анестезировали путем инъекции смеси уретана (1,5 г / кг внутрибрюшинно) и диазепама (валиум, 5 мг / кг внутрибрюшинно). Ахиллово сухожилие правой задней конечности было выделено и связан с датчиком силы, соединенным с самописцом (тип WTR331). Коленный сустав был твердо обездвижен. Два  стальных электрода были вставлены в трехглавую мышцу голени (включая быстрые волокна, гликолитических икроножной мышцы и подошвенной мышцы и медленные, окислительные камбаловидной мышцы). Прямоугольные импульсы, 0,5 мсек, были доставлены с помощью  контроллера. Напряжение  и длина мышцы были скорректированы для получения максимальной изометрической силы сокращений. Оптимальная длина мышцы была определена. Фазовое подергивание было записано и абсолютное напряжение  пика подергивания  (Pt), время до пика (ТТП), и время, в течение половины релаксации от пика (RT1 / 2) были измерены. После 3-минутной паузы, мышцы были подвергнуты  анализу тетанизации с использованием 200 мс всплесков увеличения

частоты (от 20 до 100 Гц с шагом 10 Гц)  каждые 30 с. Самый сильный ответ (обычно получается в 90 или 100 Гц) был принят в качестве абсолютного оптимального тетанического напряжения (Ро). Максимальную напряженность обычно получают в течение первых пяти стимуляций. Амплитуда отклика затем уменьшается, по мере  чего стимулы были повторены. Остаточная тетаническая напряженность выражается в процентах от максимального ответа. Абсолютное фазовое и тетаническое напряжение (в мН) были преобразованы в конкретные напряженности (в мН на мм2) после нормализации на общую площадь поперечного сечения  мышц(CSA). CSA (в мм2) определяли путем деления  массы трехглавой мышцы голени  (в мг) на произведение оптимальной длины мышцы (в мм) и  плотности скелетных мышцах млекопитающих (г = 1,06 мг · мм-3) .