Неаминогликозидный состав устраняет носенс мутации (стр. 2 )

Далее, мы использовали два известных RTC, G418 и гентамицин, чтобы проверить эффективность PTT-ИФА. Оба соединения показали значительную PTC деятельность с TAT51 мутантной  плазмидой (TGA C) в широком диапазоне доз (40 нм-10 мкм;. Рис. 1 в). Кроме того, G418 показал очевидную токсичность в реакции PTT при концентрации> 2,5 мкм, в то время как токсичность гентамицина не наблюдалось до 12.5 мкм. Эти результаты согласуются с нашими ранее опубликованными данными S35-PTT в геле (Lai и соавт., 2004) и показали, что PTT-ИФА легко идентифицирует соединения с РTC активностью.

Далее проверки анализа для использования в полностью автоматизированной 384-а платформы, с помощью плазмиды-TAT51 (TGA C) в качестве шаблона  и 1 мкМ G418 в качестве положительного контроля. Чтобы еще больше снизить затраты на анализ, мы оптимизировали уменьшение объема PTT реакции с 25 до 5 мкл. Как показано на рис. 1 D,  G418  показали значительные различные сигналы (фактор Z '> 0,8) по сравнению с контролем.

Скрининг химических соединений

Около 34000 соединений были исследованы, чтобы открыть новые RTC. Плазмида-TAT51 (TGA C) была использована для первоначальной проверки. Каждое соединение был  в конечной концентрации 10 мкМ в анализе смеси. Для каждого исследования, мы брали как положительные (с 1 мкМ G418) так и отрицательные (с ДМСО) образцы контроля качества. Наш первоначальный скрининг дал 12 низкомолекулярных RTC  с заметной активностью. Все 12 соединений были подтверждены ручной PTT-ИФА на разных концентрациях (химические названия приведены в таблице S1). Все из них  были неаминогликозидными и ни о ком из них не сообщалось ранее. Химические названия и структуры двух ведущих соединений, RTC № 13 и № 14, представлены на рис. 2, названия  и структуры для оставшихся 10 RTC приведены на рис. S1 и таблицы S1.

EC50 из пяти соединений (RTC # 4, # 11, # 13, # 14 и # 16) было <10 мкм (рис. 2, б, RTC № 13 и № 14), подразумевая, терапевтический потенциал этих соединений. Примечательно, что в этих первых клетках без экспериментов, максимальный эффект в пробирке  для нового соединения не был столь благоприятным, как и у G418 или гентамицина. Например, максимальная активность  № 13 и № 14, обнаружены в клетках  PTT-ИФА, составила ~ 10% от максимальной активности G418 и гентамицина в том же тесте (рис. 1в по сравнению с рис 2. б). Это может быть связано с растворимостью, проницаемостью, или токсичностью соединений. В отличие от этого, RTC # 13 и # 14 были EC50 <10 мкм, они менее токсичны, и они не показывают очевидного торможения PTT при высокой концентрации (> 50 мкм), в отличие от G418 и гентамицина (рис. 1С ).

Эффективность этих соединений была также протестирована на двух других  стоп-кодонах, TGA и ТАА G. Для TGA, все 12 соединений показали, различную степень  деятельности (неопубликованные данные). Для ТАА G, и шести соединений (RTC # 10, # 11, # 13, # 14, # 16 и # 17) показали заметную активность (неопубликованные данные). Данные для RTC № 13 и № 14 на рис. 2 с.

RTC - индуцированный AT белок и ATM-Ser1981 фосфорилирование в AT лимфобластоных клеточных линиях (LCLS)

Чтобы проверить возможность  вновь выявленных соединений  вызвать синтез ATM белка в клетках с AT мутациями PTC, мы обработали AT LCLS  каждым соединением в течение 4 дней до уборки клеток. Вестерн-блотт анализ  ядерных лизатов в целом недостаточно чувствителен для мониторинга  ATM белка (Lai и др., 2004.), Поэтому мы использовали ATM-ИФА метод измерения внутриядерных белков в клетках  (Butch и др., 2004). . Концентрации отдельных RTC, используемых для лечения AT153LA LCL с гомозиготной TGA мутацией были основаны на их цитотоксическом профиле (рис. S2, RTC № 13 и № 14). Клетки обрабатывали высокими концентрациями RTC, > 70% жизнеспособности по сравнению с необработанными клетками. RTC # 13 и # 14 последовательно индуцировали низкий, но заметный уровнь ATM белка в AT LCLS (рис. 3). Восстановленная ATM белка составило ≤ 5% от дикого типа LCLS. Гентамицин и G418 также индуцирует небольшое количество белка ATM (рис. 3). Мы были воодушевлены этими результатами, потому что у некоторых пациентов с остаточным синтезом белка  может произойти существенное увеличение  активности киназы ATM, и это  связано с поздним началом и медленным прогрессированием симптомов (Гилад и др., 1998;.. Чун и др. 2003). Таким образом, мы считаем, что даже незначительное повышение  белка обладают терапевтическим потенциалом.

Для оценки функции RTC - индуцированного белка ATM, мы измеряли вызванные облучением очаги (IRIF)  ATM-Ser1981 в тех же  AT153LA клетках (TGA). В клетках не образуются очаги после ионизирующего излучения (ИИ) ATM-Ser1981, потому что  белки либо отсутствуют, либо функционально нарушены (обычно бывшей). Мы обнаружили, что RTC # 13 и # 14 индуцировали значительное количество  Ser1981 IRIFs в AT клетках TGA, тогда как только фоновый уровень IRIF наблюдался в необработанных контрольных образцах (рис. 3 б). В то же время, ~ 51% от дикого типа клеток показали, различные  очаги. Максимальная индукция IRIF достигнута в AT клетках 10 мкм RTC # 13 было ~ 40% дикого уровня. В качестве положительного контроля, 144 мкМ G418 (100 мкг / мл) был использован для лечения клеток. Наши предыдущие исследования показали, что при такой концентрации, G418 вызывали максимальный уровень ATM1981 IRIF (Lai и соавт., 2004). Как и ожидалось, значительная IRIF была вызвана в G418-обработанных клетках. Уровень в AT клетках составляет примерно половину от  клеткок дикого типа. Соединения были также протестированы в другой AT клеточной линии, AT229LA, с гомозиготной TAG мутацией, и оба RTC # 13 и # 14 индуцировали значительное число  Ser1981 IRIF, по сравнению с необработанными AT клетками (рис. 3с).

Для дальнейшего сравнения  деятельности RTC № 13 и № 14 с гентамицином и G418, мы использовали проточную цитометрию (FC) на основе анализа ATM-Ser1981 фосфорилирования для оценки  активности в клетках AT229LA (TAG;. Рис. 4). Оба RTC # 13 и # 14 индуцировали увеличение ATM-Ser1981 аутофосфорилирования, о чем свидетельствует сдвиг вправо интенсивности флуоресценции (FI). Это согласуется с предыдущими ATM IRIF

данными (рис. 3в). Обнадеживает тот факт, что ATM-Ser1981 фосфорилирование  индуцированных RTC # 13 и # 14 было аналогично тем, индуцированным одними и теми же концентрациями гентамицина и G418 в одной клеточной линии (рис. 4). Ни одно из двух соединений  не дает зеленой флуоресценции (изотипа контроля;. Рис. 4, правая верхняя гистограмма). Подобные эффекты  наблюдались также в клетках AT153LA (TGA) с помощью цитометрии на основе анализа ATM-Ser1981 фосфорилирования (неопубликованные данные).

РТС-индуцированние восстановление SMC1-Ser966 фосфорилирования в AT LCLS

В качестве альтернативы тесту для оценки функции киназы ATM, мы использовали недавно разработанную FC на основе анализа для оценки транс-фосфорилирования SMC1 в AT LCLS (рис. 5,. Нахас и др., 2009). ATM фосфорилирует SMC1 в Ser966 и Ser957 после IR - индуцированных двунитевых разрывов (Язди и др., 2002;.. Китагава и др., 2004) и IR - индуцированное SMC1 фосфорилирование снижено в  AT клетках. В необработанных клетках AT153LA (TGA) мы не наблюдали фосфорилирования SMC1 (рис. 5, сверху, слева). После лечения  RTC # 13 или # 14  в FI наблюдалось  восстановление АТМ киназы. И G418 и гентамицин индуцировали SMC1 фосфорилирование в клетках AT на том же уровне. Мы также протестировали соединения на TAG мутации с использованием AT229LA клеток. У всех  обнаружено индуцированние SMC1 фосфорилирования (рис. 5 б).

RTC - индуцированное восстановления АТМ киназы в AT фибробластах.

Чтобы определить, являются ли два RTC также активны и в других типах клеток, мы проверили их на линии AT фибробластов  GM02052, которые содержали гомозиготные TGA G мутации (около 103C → T). RTC-обработанные клетки показали небольшое  увеличение IR-индуцированного SMC1-Ser966 (рис. 6) и ATM-Ser1981 фосфорилирования (рис. 6 б), по сравнению с необработанными клетками. В качестве положительного контроля использовались гентамицин и G418  в схожих концентрациях.

RTC-индуцированная  коррекция клеточной выживаемости в А-T LCL.

Затем  мы  проверили, действительно ли RTC № 13 и № 14 может отменить AT радиочувствительность клеток. AT153LA клетки (TGA) лечили соединением  4 дня  и затем провели оценку жизнеспособности колоний (CSA). Один дикий тип клеточной линии  был использован в качестве контроля качества анализа. Как и ожидалось, дикий  тип и клетки после лечения показали 49 и 11% выживаемости, соответственно. Это было в пределах нормы (> 36%) и (<21%) диапазона радиочувствительности, соответственно (рис. 7). Необработанные клетки AT153LA показали 13,5% выживания (рис. 7, левая панель). Обнадеживает то, что мы обнаружили, что оба RTC № 13 и № 14 (на 10 и 20 мкм) снизили  радиочувствительность AT153LA клетки. G418 также снизил  радиочувствительность, в то время как гентамицин не показывает существенного влияния на результаты анализа в  проверенных концентрациях (10 и 20 мкм).Определение спектра CSA использовалось ранее  в нашей лаборатории, и используется для клинической диагностики AT (см. Материалы и методы).