Определение гемагглютинина методом орид — самая критическая стадия производства вирусинактивированных гриппозных вакцин? (стр. 2 )

К недостаткам метода ОРИД для определения ГА являются и длительность самой процедуры ОРИД (20-22 ч общее время,  6-8 ч интенсивных ручных операций для хорошо тренированного аналитика), что не дает возможности оперативно решать любые возникающие проблемы при производстве вакцины (31). К тому же метод ОРИД имеет узкий рабочий диапазон (6-30 мкг/мл), что требует повторного анализа или подбора необходимых разведений (для высокодозовых) или концентрирования (для низкодозовых) для различных типов вакцин и на различных стадиях технологического процесса.  По сравнению с другими антительными методами он требует более значительного объема АС,  в 50 раз больше чем ELISA (32).  Метод ОРИД требует использования для каждого вакцинного штамма отдельного геля, т. е. для тривакцины – трех гелей,  для тетравакцины – 4-ех гелей,  что является не совсем рациональной процедурой.

На сегодняшний день самым узким местом в производстве гриппозных вакцин стало время,  требуемое для производства реагентов для ОРИД, состоящее из многочисленных и довольно сложных стадий.  Из которых самой длительной процедурой, являются не стадии, касающиеся получения референс антигена : 1) получение высокоочищенного цельновирионного препарата вируса гриппа для ОРИД в качестве референс антигена гемагглютинина, 2) отправка его на контроль в национальную лабораторию или лабораторию ВОЗ и получение первичного жидкого стандарта гемагглютинина по данным электрофореза и общего белка (завышение содержания ГА может привести к критическому снижению объемов производства вакцины),  относительно которого по данным общего белка и относительного содержания ГА среди других белков вируса гриппа по данным денситометрического анализа электрофоретических полос,  калибруется вторичный антиген референс реагент.  А стадии получения поликлональной АС, включающие : 1) получение высокоочищеннного пригодного для иммунизации субъединичного ГА, а именно свободного от нейраминидазы,  внутренних белков вируса гриппа (М и NP белков) и белков эмбриона кур, или от других белков субстрата репродукции ГА,  2) как минимум 3-кратную иммунизацию баранов (получение высокотитражной сыворотки по данным РТГА и РИД) для получения поликлональной антисыворотки, 3) гомологичное калибрование (титрование) антигена и антисыворотки,  4) распределение референс реагентов (антигена и антисыворотки) контролирущими органами производителям вакцин для определения содержания ГА.  При этом к сожалению выбор баранов для иммунизации не обоснован,  так как первоначально при разработке метода ОРИД использовались другие животные.  Также пока не  аргументированы схема иммунизации,  конкретные правила пулирования сывороток по перекрестности,  титру, качеству преципитационных зон и другим показателям.  Проблема своевременного получения референс АС стала главным лимитирующим звеном в производстве гриппозных вакцин по мнению EDQM/Европейского директората по качеству лекарственных средств и здравоохранения (33).  Этот процесс получения специфичной АС для ОРИД может занимать от 2 до 4 мес (30) из общих 6 мес предназначенных для производства вакцины,  т. е. большую часть времени производства,  что существенным образом осложняет производство вирусинактивированных  вакцин против вируса гриппа (31). Типично  реагенты становятся доступны в июле для Северного полушария, приблизительно, через 4 мес после решения контролирующих органов по штамму в конце февраля,  что затрудняет своевременность не только проведения валидации (34), но и производства вакцины.  Антисыворотка для метода ОРИД производится путем иммунизации баранов высокоочищенным гемагглютинином,  полученным из рекомендованного ВОЗ штамма или его производного/подобного/like (как правило антисыворотка общая для всех рекомендованных щтаммов),  в то время как референс антиген должен быть штаммом, используемым конкретно производителем в вакцине. График использования реагентов таков,  что материал,  используемый для получения референс антигена,  как правило может поставляться национальному органу контроля только производителем вакцины.  Кооперативный характер производства и калибровки реагентов между производителем вакцины и контролирующим органом (органами) и необходимость быстрого производства вакцины,  делают график выполнения сложным.  2018 год стал для АО «НПО «Микроген» прорывным,  так как впервые в истории развития организации кроме поставки вакцинных штаммов из NIBSC,  были дополнительно открыты c помощью управления централизованного материально-технического снабжения АО «НПО «Микроген» (, ) и отдела логистики () два альтернативных поставщика – CDC (Centers for Disease Control and Prevention/Центр по контролю и профилактике заболеваний, США),  NYMC (New York Medical College/Нью-Йоркский медицинский колледж), которые как правило немногим раньше имеют в наличии вакцинные штаммы,  правда на 1-2 пассажа меньше чем у NIBSC,  что позволяет получить так необходимые временные преимущества как для производства вакцины, так и для получения контрольных материалов.  Кроме того NYMC как раз занимается высокопродуктивными реассортантами типа В вируса гриппа (Doris J. Bucher, Ph. D. associate professor of microbiology and immunology).  Разрешите выразить самую глубокую признательность в этом Dr.  Xiyan Xu  (Deputy Director WHO Collaborating Center for Surveillance, Epidemiolofy and Control of Influenza Lead Virus Reference Team Virology, Surveillance and Diagnosis Branch Influenza Division, CDC) и Jeanmarie Silverman, MS  (Research Technician Microbiology and Immunology New York Medical College),  которые оперативно поставили заявленные нами вакцинные штаммы.  Однако поставка вакцинных штаммов производителям вакцин эта тема отдельного разговора.

Одним из главных недостатков метода ОРИД является метод получения высокоочищенного ГА для получения АС (для иммунизации баранов),  который получают высвобождением ГА без трансмембранного домена (transmembrane domain) из вируса гриппа, с помощью обработки дорогостоящим ферментом - бромелаином (ВОЗ-ский официальный метод очистки ГА). Своевременность производства вакцины против пандемичного штамма  (H1N1pdm09) - 2009-H1N1, была поставлена под угрозу из-за того, что молекулы ГА штамма H1N1pdm09 были экстремально чувствительны к расщеплению бромелаину, что сделало очень затруднительным очистку ГА для иммунизации баранов, и,  в значительной степени замедлило доступность реагентов для оценки активности вакцин против гриппа, и,  соответственно,  отсрочило  выпуск серий противопандемичных вакцин в мире (35).  Только через 5 мес от принятия решения к началу производства,  противопандемичная вакцина стала доступна для населения, т. е. она оказалась не в достаточном количестве ко 2-ой волне пандемии  (36).  Прозвучала оценка данной ситуации «слишком мало вакцины, слишком поздно».  Экстремальная чувствительность ГА к бромелаину затруднила своевременное получение критического реагента –  АС и для других пандемичных и препандемичных вакцин,  в частности,  для  подтипа H5N1 (3),  для подтипа Н7N9 (37).  Угрожающим моментом для ГА подтипа H5N1 является непостоянство результатов ДДС-ПААГ анализа, что затрудняет калибрование первичного жидкого стандарта (38).  Следовательно, использование метода ОРИД, является  особенно проблематичным для производства препандемичных и пандемичных вакцин, и не только из-за лимита времени, но и экстремальной чувствительности ГА к бромелаину.  Все это требует наличия альтернативных,  быстрых,  высокоэффективных с сохранением нативности ГА методов очистки ГА от примесных белков и получения АС не только в рамках рекомендованного метода ВОЗ (NIBSC, TGA),  но и на базе кооперации крупнейших отечественных производителей инактивированных гриппозных вакцин с национальным органом контроля - ФГБУ НЦЭСМП МЗ РФ () и ведущим национальным учреждением по гриппу - ФГБУ НИИ гриппа МЗ РФ () и по получению вакцинных штаммов - НИИЭМ Северо-Западного отделения РАМН (отдел вирусологии им. , , ) .  В настоящее время официальный производитель отечественных антисывороток к ГА для метода ОРИД отсутствует.  Наиболее полно альтернативные методы очистки ГА с использованием тритона Х100, октилглюкозида, аффинной хроматографии, опубликованы в работе (39).  В настоящее время интересным является появление за рубежом двух альтернативных подходов, использование, во-1-ых, ГА-экспрессирующего вектора, не зависимого от наличия доступного штамма вакцинного цельного вируса, и от очистки (от бромелаина),  но требующего специального оформления ГА в виде вирусо-подобных частиц (40);  и,  во-2-ых, рекомбинантного ГА (37).

С 2014 г АО «НПО «Микроген» филиал «Иммунопрепарат» получил 7 протоколов испытаний  антисывороток собственного производства от национального органа контроля – ФГБУ научного центра экспертизы средств медицинского применения МЗ РФ, что позволило их использовать для выполнения тем НИОКР по разработке сплит-вакцины и тетравакцин.  На сегодняшний день в связи с появлением тритона Х100, минимально поглощающего в УФ-области (возможность контроля при хроматографии),  других углеводсодержащих детергентов, новых аффинных сорбентов,  происходит дальнейшее улучшение методов очистки ГА (данные не опубликованы). 

Следующей проблемой ОРИД для оценки ГА вируса гриппа является замена одной серии референс АГ и референс АС на новые, которая решается  не характерным для других стандартов ВОЗ и NIBSC способом,  из-за несоотвествия конформаций «нового» и «старого» антигена-ГА.  Новая серия (другой каталожный номер) стандарта не приравнивается к старой,  и, поэтому,  в каждый вакцинный сезон рекомендуется пользоваться только одним стоком реагента.  ОРИД плохо работает с адъювантами на основе алюминия (26),  поэтому при выявлении интерференции с адъювантом/носителем допускается проводить измерение ГА до добавления адъюванта/носиили проводить элюцию ГА (42).  Некоторые штаммы дают в ОРИД узкие зоны иммунопреципитации,  в то время как другие, могут давать туманные или смешанные зоны, что затрудняет количественную оценку (26),  что требует поиска путей решения данной проблемы.