Определение гемагглютинина методом орид — самая критическая стадия производства вирусинактивированных гриппозных вакцин? (стр. 1 )

DETERMINATION OF HEMAGGLUTININ BY SRID METHOD - THE CRITICAL STAGE OF THE PRODUCTION OF VIRUSINACTIVATED INFLUENZA VACCINES?

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЕМАГГЛЮТИНИНА МЕТОДОМ ОРИД – САМАЯ КРИТИЧЕСКАЯ СТАДИЯ ПРОИЗВОДСТВА ВИРУСИНАКТИВИРОВАННЫХ ГРИППОЗНЫХ ВАКЦИН?

1, 1, 1, 1, 2, 2

1 - Филиал АО «НПО «Микроген» в г. Уфа «Иммунопрепарат»

2- АО «НПО «Микроген», г. Москва

Все методы количественной оценки гемагглютинина (ГА) делятся на иммунные методы исследования или антитело-зависимые и на неиммунные методы или антитело-независимые.  Первые  оценивают структурно интактные или нативные белки в отличие от физических методов типа электрофореза, хроматографии (HPLC) или масс-спектрометрии (1, 2, 3, 4),  которые оценивают ГА  по размеру (молекулярный вес), либо по структуре.  Иммунные методы исследования несмотря на зависимость от наличия специфических антител, обеспечивают не только  прямое количественное определение структурно интактного ГА,  но, и,  контроль его стабильности.  Возможность иммунного метода анализа ГА доказывать сохранение стабильности имеет определяющее значение,  так как лицензирование вакцин против гриппа требует не только определения активности, но также оценки стабильности как в реальном времени (5), так и при ускоренном старении (6) и для моновалентов (антиген субстанций), и для конечной вакцины.  Из-за высокой чувствительности к временному показателю производства сезонных гриппозных вакцин,  исследование ускоренной деградации считается критическим инструментом для быстрой оценки стабильности моно - и поливалентных вакцин (7).  Первоначально содержание ГА измеряли с помощью метода агглютинации эритроцитов (8), который оценивает гемагглютинирующую активность.  Метод был отстандартизован с использованием международного стандарта ГА для гемагглютинации, содержащего 18,7322 мг ГА (тип А), где за 1 одну международную гемаглютинирующую единицу активности признавалось 0,093661 мг ГА  (9).

Однако метод или реакция гемагглютинации (РГА) имеет большое количество неконтролируемых переменных,  включая специфическую активность конкретного вируса при агглютинации эритроцитов, которая варьирует от штамма к штамму, а также имеет различия в активности на разных типах вакцин - цельновирионных, расщепленных и субъединичных, поэтому отклонения могут достигать 100-200 %, или 2-кратного разведения (10).  Дополнительно, метод гемагглютинации не может провести дифференциацию между типами вирусов А и В, между подтипами вирусов,  например, между Н1N1 и H3N2,  т. е. имеет низкую специфичность.  Главное, что РГА имеет низкую корреляцию с иммуногенностью на людях (11).  Также к недостаткам метода гемагглютинации относят, - большую вариабельность результатов в зависимости : во-1-ых,  от вида используемых эритроцитов - человека, гусиные, куриные и т д, а также выпадение получаемых данных по вирусам гриппа, относящимся не к человеческим субтипам, а птицам, например, к Н5N1 (12),  во-2-ых,  от различных серий одного и того же вида эритроцитов.  Полностью отойти от метода гемагглютинации не получается так как он является функциональнальным методом исследования,  подтверждающим качество ГА (олигомерность, тримеры) (13),  предназначенного для иммунизации с целью получения референс антисыворотки (АС) для одиночной радиальной иммунодиффузии (ОРИД).  Согласно  ФС.3.3.1.0028.15 Вакцина гриппозная инактивированная (ГФ 13)  стандарт ГА (антиген) в виде цельного вируса для проведения ОРИД должен содержать не ниже 1:32000 гемагглютинирующих единиц при концентрации гемагглютинина 25-50 мкг/мл.  Кроме этого достаточность циклов иммунизации баранов проверяется по титру торможения гемагглютинации сыворотки (титр не ниже 1:5000).  К основному преимуществу метода РГА в обычной общелабораторной практике можно отнести отсутствие необходимости как в референс антигене (АГ), так и референс АС,  т. е. независимость от наличия стандартных материалов.  В силу вероятно выше указанных недостатков, ВОЗ в 1978 г сообщил о невозможности использования международного стандарта для гемагглютинации для количественного определения содержания ГА в вирусинактивированных гриппозных вакцинах и, соответственно, отказался и от метода РГА  (14).

Wood J. M., Schild G. C., Newman R. W., Seagroatt V. (15) обнаружили относительно постоянное соотношение между титром гемагглютинации и содержанием ГА, определенное методом ОРИД для конкретного штамма для цельного вируса, однако его варьирование оказалось значительным между различными штаммами от 16,5 до 26,8 ЕД/мкг ГА.  Для субъединичных вакцин вариация оказалась еще более значительной от 1,4 до 16,6 ЕД/мкг ГА,  однако при этом как видите,  само соотношение было значительно ниже чем для ГА цельного вируса. (15).  Вышеуказанные авторы выяснили причину этого, занижение данных по ГА в субъединичных вакцинах при использовании метода гемагглютинации обусловлено более высоким содержанием мономерных форм ГА, т. е. результат РГА зависит и от физического состояния  субъединиц – мономеры, димеры, тримеры или в составе цельного вируса.  Как выход,  ими предложено для определения специфической активности вакцин перейти на метод ОРИД,  который из за высокой специфичности и правильности пригоден для использования не только для моно, но и для поливалентных гриппозных вакцин.  К тому же метод ОРИД в отличие от РГА работает независимо от типа вакцин – цельновирионные, сплит или субъединичные.  Преимуществом является и то, что на ОРИД как правило не влияет ни расщепление вируса, ни очистка ГА в  процессе вакцинного производства.  На первый план ОРИД среди других методов вывели  данные по его корреляции с иммуногенностью и результатами клинических испытаний  (16, 17, 18, 19, 20).

  Согласно существующих международных нормативных требований в любых типах инактивированных гриппозных вакцин как правило в каждой дозе классической безадъювантной вакцины должно содержаться 15 микрограмм ГА для каждого вакцинного штамма (монографии № 000 Европейской Фармакопеи (ЕФ) INFLUENZA VACCINE (SURFACE ANTIGEN INACTIVATED), № 000 INFLUENZA VACCINE (SURFACE ANTIGEN, INACTIVATED, VIROSOME), № 000 INFLUENZA VACCINE (WHOLE VIRION, INACTIVATED), № 000 INFLUENZA VACCINE (SPLIT VIRION, INACTIVATED),  № 000 INFLUENZA VACCINE (SURFACE ANTIGEN, INACTIVATED, PREPARED IN CELL CULTURES), 2308 INFLUENZA VACCINE (WHOLE VIRION, INACTIVATED, PREPARED IN CELL CULTURES), за исключением других количеств ГА, подтвержденными клиническими данными. В качестве метода оценки они все предлагают использовать метод ОРИД (дословно иммунодиффузионный тест), который измеряет активность ГА в его нативной конформации.  В настоящее время все производители гриппозных вакцин для количественного определения ГА в вакцинах и полуфабрикатах содержащих вирус гриппа используют метод ОРИД.  Принцип основан на иммунохимической реакции антитела и антигена в геле, причем измеряется биологически или иммунологически активная, нативная форма ГА,  в то время как денатурированный/агрегированный ГА не преципитируется антителами  (11, 21).  Для проведения ОРИД требуются два обязательных реагента,  поликлональная антисыворотка к гомологичному штамму и  референс АГ с известной активностью, который должен быть гомологичен штамму используемому в вакцине.  Исторически первым использовал ОРИД G Schild c соавт. в 1975 гг (22) для измерения ГА.  Wood J. M. с соавт. (15) в 1977 г усовершенствовали ОРИД выразив активность в мкг ГА на мл.  На тот момент АС была кроличьего или козъего происхождения.  Метод ОРИД или SRD или SRID в качестве теста на содержание антигена вируса гриппа был аттестован и валидирован в 1970-х годах (15, 23).  В итоге ВОЗ признал все юридические права за методом ОРИД,  поручив обеспечение материалами для ОРИД - NIBSC (National Institute for Biological Standards and Control/национальному институту биологических стандартов и контроля, Великобритания).  ОРИД заменил РГА и стал золотым стандартом измерения ГА с 1978 г. На сегодняшний день метод ОРИД для контроля содержания ГА авторизован всеми международными контролирующими органами – ВОЗ, FDA (Food and Drug Administration/Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов),  EMA (European medicines agency/Европейское агентстволекарственных средств),  ЕФ, МЗ РФ (24, 25).

Одной из критических стадий производства гриппозных вакцин уже многие годы считается количественное определение ГА. Хотя золотым стандартом до сих пор остается  метод ОРИД,  но к нему у некоторых специалистов на сегодняшний день появилось много вопросов,  особенно у тех,  кто предлагает альтернативные методы измерения.  При том ни одного отрицательного международного/коллаборативного исследования по методу ОРИД не обнаружено в доступной литературе.  По мнению Moisset P.-A., Pederson J. and Landry N. (26) к критическим параметрам метода ОРИД можно отнести тип агарозы,  используемый метод статистики, подложка для геля агарозы, реагенты, дизайн платы для геля, оборудование для нанесения пробы в гель, прозрачность/адгезивность/гомогенность/толщина геля и отсутствие в нем пузырьков воздуха, инструмент/оборудование для измерения колец.  Если проблема ускорения технологического цикла производства гриппозных инактивированных вакцин в принципе решилась при переходе с фертилизированных яиц на культуру клеток,  что особенно актуально для пандемичных и препандемичных вакцин, то метод контроля до сих пор остается архаичным,  заключающимся в измерении размера колец в геле иммунодиффузионным методом.  По мнению некоторых исследователей ему присущи следующие недостатки – низкая чувствительность и низкая точность (25, 27),  высокая вариабельность (28)  Эта низкая чувствительность создает проблемы определения ГА в культуральной, вирус-аллантоисной  жидкости и в низкодозовых по ГА вакцинах – внутрикожных и содержащих адъювант/носитель, что  требует концентрирования проб перед измерением.  Недостатком ОРИД являются не совсем правильные результаты оценки в грубых или загрязненных образцах,  где концентрация ГА низкая и высокая белков контаминантов (29),  что предполагает специальной пробоподготовки.  Хотя анализ методом ОРИД технически прост, не требует сложного оборудования,  его практическая реализация является сложной, во-1-ых,  из-за  обязательной потребности в  обоих специфичных реагентах – антигене  и антителах, и, во-2-ых, из-за ежегодного изменения штаммов, включаемых в вакцину, что кардинально отличает вакцины против гриппа от любых других.  Так например, при анализе 21-летнего периода с 1980/1981  по 2000/2001 (30), произошло 14 штаммовых смен в вакцине по Н3N2, 8 - по Н1N1 и 10 - по типу В.  Следовательно, за 21 год произошло 34 изменения или в среднем 1,6 изменений в год.  В настоящее время в связи с переходом на тетравалентные вакцины эти  изменения будут происходить еще более часто и поэтому объем и масштабы работ для ВОЗ, NIBSC, TGA (Therapeutic Goods Administratioin/Австралийская администрация лекарственных средств) будут только возрастать, так как эти международные центры занимаются вопросами обеспечения производителей вакцин референс-антигенами и референс-антисыворотками.