Определение гемагглютинина методом орид — самая критическая стадия производства вирусинактивированных гриппозных вакцин? (стр. 3 )

Следующей проблемой ОРИД является то,  что АС при переводе ее в гель агарозы нагревается до 56 оС,  что может приводить к потере функциональности некоторых нестабильных ГА-связывающих участков антител,  поэтому переход на агарозу с температурой плавления не более 50 оС (фирма SIGMA-ALDRICH кат №  A5030 Agarose Ultra-low Gelling Temperature) может до некоторой степени решить возможные проблемы снижения, изменения, нарушения реактивности поликлональной АС к ГА, так как при температуре 56 оС возможны конформационные изменения антител.

ОРИД занижает содержание ГА,  получаемого на культуре клеток при использовании реагентов для ОРИД,  произведенных на куриных эмбрионах (43),  что лишает возможности унифицированного подхода к использованию единых реагентов для определения ГА выращенного на различных платформах/субстратах репродукции вируса.  Одним из механизмов этого является различная аффинность антител в получаемой АС, которая  зависит от субстрата репродукции гемагглютинина,  так как различные экспрессионные системы обуславливают различные варианты N-гликозилирования (26).  Следовательно, не является адекватным использование одних и тех же реагентов для ОРИД для вакцин, получаемых в другой системе, не на яйцах, а на культуре клеток или с помощью рекомбинантной ДНК технологии (44).  Эта проблема решаема за счет предоставления референс АГ и АС производителями вакцин, получаемых на различных платформах контролирующим органам.

Cледующим недостатком ОРИД является проблема диффузии в геле аггрегированных форм гемагглютинина (занижение данных), так как аггрегация характерна для концентрированных форм гемагглютинина (45) и для ГА, получаемого на культуре клеток.  Эта проблема также решаема при контроле вакцины по показателю  молекулярно-массовое распределение или размер частиц и,  при необходимости проведения дезаггрегации,  до проведения анализа.  ОРИД может также дать не реальные результаты активности ГА когда различные методы инактивации вируса гриппа используются для референс стандарта ГА и для вакцины (46).  Это по мнению Semenova E., Post P., Fields T., Cox  M. (47) приводит к различной модификации ГА, и,  как результат к различной его подвижности,  и электрофоретической, и в геле агарозы,  к образованию различных комплексов в том числе и с примесями,  куда входят клетки продуценты – яйца или культура клеток.  Эта проблема также решаема как за счет гармонизации метода инактивации живого вируса гриппа между различными производителями вакцин, и выбора единственного,  либо предоставления различных референс АГ, полученных различными методами  инактивации производителями вакцин контролирующим/распределяющим органам.

Возвращаясь к референс антигену, хотелось бы отметить, что калибрование первичного жидкого стандарта ГА осуществляется не иммунологическим/иммунохимическим,  а физико-химическим методом (48),  который не соответствует области использования – методу ОРИД по механизму реакции.  Но при мягкости методов выделения ГА близость результатов обоих методов скорее всего будет максимально близкой.  Выявилась дополнительная проблема стандартизации первичного жидкого стандарта ГА.  Другие,  не ГА-протеины в электрофоретической полосе ГА по данным масс-спектрометрии могут достигать 25 %,  что ставит под сомнение адекватность использования электрофореза в существующем виде денситометрической оценки (49).  По данным Moisset P.-A., Pederson J. and Landry N. (26) расхождение может достигать куда еще больших значений – от снижения на 34 % до превышения на 100 % по всем типа/субтипам,  и даже до превышения на 200 % (50) при использовании масс-спектрометрии - LC-MS (жидкостная хроматография с тандемной масс-спектрометрией).  Отклонения могут быть вызваны и тем, что в электрофорезе выпадают из измерения белки, не попадающие в гель, и убежавшие из геля.  Анализ семи пандемичных вакцин Н1N1 (26) показал, что содержание ГА по методу ОРИД составило от 33 до 67 % от масс-спектрометрического.  Наибольшее завышение результатов по ОРИД характерно для подтипа Н3N2 и типа В.  Поэтому переход ВОЗ/NIBSC/TGA/ЕDQM на учет количественного содержания ГА в составе анализируемых электрофоретических полос с помощью современного масс-спектрометрического метода LC-MS при первичной калибровке гемагглютинина позволило бы снять возможную критику и повысило достоверность/правильность метода.  К сожалению, использование только дегликозилирования ГА со стандартной процедурой калибрования ВОЗ (51), без масс-спектрометрического LC-MS учета также не решит проблему адекватного анализа примесей в полосе ГА при проведении стандартизации.

Кроме того, согласно ежегодных рекомендаций ВОЗ по вакцинным штаммам (http://www. who. int/influenza/vaccines/virus/recommendations/en/), которые должны быть включены в вакцину, как правило определяют вирусы, подходящие для производства вакцины, как «похожие»/прототипные/ссылочные штаммы.  При этом производители вакцин большей частью  используют модифицированные лабораторные штаммы (в последнее время и по типу В),  которые растут в более высоких титрах (чем дикие типы) и с меньшими проблемами (более стабильны) обрабатываются на стадиях технологического процесса.  Различные производители вакцин могут использовать  различные модифицированные штаммы (34),  что может поставить под сомнение существующий выбор вакцинного штамма вируса гриппа,  который ВОЗ называет «подобным»/прототипу – референсному штамму,  дикому, так как его нельзя считать полностью соответствующим  циркулирующему вирусу,  так как вакцинный штамм получают, как правило, за счет реассортации с высокопродуктивным вариантом лабораторного штамма, и, в итоге получают в самом начале модифицированные штаммы с ГА и NA от нового и родительского штаммов.  Следовательно,  имеется возможность не полного соответствия между реассортантом и диким штаммом,  между иммуногеном (вакциной) и вирусом, ответственным за заболевание гриппом.  Но в случае АС аттестуется единственная антисыворотка,  для нее не требуется полного соответствия получаемой антисыворотки всем разрешенным актуальным вакцинным штаммам вируса гриппа (всем вариантам), т. е. каждому по отдельности. Другим вероятным недостатком видится эквивалентное право использования всех антигенов – всех вирусных вакцинных штаммов,  используемых для получения вакцины, в том числе – реассортантов.  Наверное более адекватным выглядело бы,  как и в случае с антисывороткой,  использование для ОРИД единственного вирус-антигена исходного/прототипного для снятия возможных вопросов по полной эквивалентности. 

В связи с появлением квадривалентных вакцин в самом начале их разработки появилась проблема завышения результатов определения ГА по обеим линиям типа В (Ямагата, Виктория) из-за незначительной перекрестности при использовании антисывороток CBER в отличие от TGA и NIBSC (26), что требует уточнения как к качеству чистоты высокоочищенного гемагглютинина типа В, так и к особым правилам иммунизации типа В вируса,  без накопления перекрестно реагирующих антител.  В настоящее время публикаций о проблеме использования антисывороток к типу В в квадривалентных вакцинах производства CBER отсутствуют,  что говорит о положительном разрешении данной ситуации.  В случае данной проблемы поликлональные антисыворотки обычно проверяются на перекрестность между двумя линиями типа В и ОРИД модифицируется при использовании для квадривалентных вакцин с помощью специального формулирования бивалентного референс стандарта,  содержащего равные количества референс антигена каждой линии типа В (52).

Следующим важным моментом метода ОРИД является метод обсчета получаемых данных.  Так как кривая доза ответ может быть нелинейной для метода ОРИД,  то для подсчета используется два способа – модель отношений углов наклонов (Европа) и метод параллельных линий (США).  Первый хотя и проще,  но имеет больше недостатков – возможность отсутствия общей точки пересечения стандарта и тестового образца,  более частые проблемы с линейностью из-за использования  области нижней асимптоты сигмоидальной кривой зависимости "доза-ответ", где оценка является менее эффективной, т. е. тест может не пройти по двум критериям приемлемости (15, 53).  По данным Wood J. M., Seagroatt V., Schild G. C., Mayner R. E., Ennis F. A. (54)  в некоторых лабораториях при использовании метода отношений углов наклонов  тест ОРИД может не пройти по двум вышеуказанным критериям приемлемости.  В РФ используется метод отношений углов наклонов (ФС.3.3.1.0028.15 Вакцина гриппозная инактивированная (ГФ 13),  однако с учетом гармонизации требований Европейской и Американской Фармакопей,  производители ждут не дождутся приведения метода количественного определения ГА к единым требованиям.  В пользу метода параллельных линий говорит и обязательное условие возможности объединения/пулирования антисывороток для ОРИД от различных животных – равность углов наклонов в методе параллельных линий (13).

       В итоге большинство проблем метода ОРИД для оценки активности вирусинактивированных гриппозных вакцин решаемо и может быть проиллюстрировано в основном виде в ниже приведенной схеме.

НЕКОТОРЫЕ СЛОЖНОСТИ МЕТОДА ОРИД ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ИНАКТИВИРОВАННЫХ ГРИППОЗНЫХ ВАКЦИН :

Обязательная потребность в  обоих специфичных реагентах – антигене  и антисыворотке (антителах). В реакции антиген – антитело участвуют только преципитирующие антитела, выпадают из измерения не преципитирующие. Трудоемкий (высокая доля ручного труда), длительный, не современный. Низкая чувствительность, низкая точность, высокая вариабельность, узкий рабочий диапазон. Возможная проблема нагревание антисыворотки до 56 оС при переводе в гель агарозы,  что может приводить к снижению, изменению, нарушению реактивности функциональности некоторых нестабильных гемагглютинин-связывающих конформационны участков антител. Проблема определения в культуральной и вирус-аллантоисной жидкости из-за высокой концентрации белков контаминантов и низкой гемагглютинина. Проблема определения в низкодозовых по гемагглютинину вакцинах – адъювантных (адъювант/носитель), внутрикожных; в адъювантных дополнительно из-за необходимости проведения элюции гемагглютинина или определения до внесения адъюванта. Требует значительного объема антисыворотки, как минимум на порядок по сравнению с современными антительными методами. Для каждого вакцинного штамма требуется отдельный гель, для тривакцины – три геля, для тетравакцины  – 4 геля. Ежегодное изменение штаммов, включаемых в вакцину требует ежегодного получения новых антигенов  и антисывороток (антител) и ежегодной ревалидации. Возможность отсутствия полного соответствия между рекомендованным/объявленным штаммом и реассортантом, между вакцинным штаммом и вирусом, ответственным за заболевание гриппом у людей.  Длительность и сложность производства реагентов для ОРИД.  Длительность получения антисыворотки из-за необходимости 3-кратной иммунизации баранов, которая может занимать  от 2 до 4 мес  из общих 6 месяцев, предназначенных для производства вакцины. Проблема получения высокоочищенного гемагглютинина при выделении бромелаином (метод ВОЗ), отсутствует  трансмембранный домен, поэтому неполное соответствие нативному гемагглютинину в составе цельного вируса. Наличие чувствительных к бромелаину штаммов вируса гриппа.  Отсутствуют альтернативные официально  признанные (ВОЗ, ЕФ, USP, FDA) методы очистки гемагглютинина. Экстремальная чувствительность гемагглютинина к расщеплению бромелаину (метод ВОЗ) некоторых пандемичных и препандемичных штаммов вируса гриппа. Проблема стандартизации гемагглютинина на основе первичного жидкого стандарта гемагглютинина по данным электрофореза и общего белка (первичная стандартизация физическим методом). Необходимость перехода на масс-спектрометрическую оценку ˗ LC-MS. Взаимозависимый характер производства и калибровки реагентов для ОРИД между производителями вакцин и контролирующими органами. Запоздалое проведение валидации метода ОРИД из-за длительности получения антисыворотки. Проблема замены одной серии рефенс антигена или референс антисыворотки на новую при сохранении штамма на следующий сезон, из-за не соответствия конформаций «нового» и «старого» антигена/ антисыворотки,  поэтому новая серия имеет другой каталожный номер. Проблема диффузии в геле аггрегированных форм гемагглютинина (занижение данных), так как аггрегация характерна для концентрированных форм гемагглютинина, требует контроля за аггрегацией. ОРИД занижает содержание гемагглютинина, получаемого на культуре клеток при использовании реагентов для ОРИД, произведенных на куриных эмбрионах, что лишает возможности унифицированного подхода к использованию единых реагентов для определения гемагглютинина, выращенного в различных платформах/субстратах репродукции вируса. В том числе и с помощью рекомбинантной ДНК технологии. ОРИД может дать не реальные результаты активности когда различные методы инактивации вируса гриппа используются для референс стандарта гемагглютинина и вакцины. Возможная инактивация гемагглютинина в процессе инактивации живого вируса гриппа в процессе получения референс антигена, может нарушить нативную конформацию гемагглютинина. В некоторых случаях наблюдается проблема завышения результатов определения гемагглютинина по обеим линиям типа В (Ямагата, Виктория) в квадривалентных вакцинах из-за перекрестности, что требует уточнения как к чистоте высокоочищенного гемагглютинина типа В (для иммунизации), так и к особым правилам иммунизации. Выбор баранов для иммунизации не обоснован,  так же не  аргументированы схема иммунизации, правила пулирования сывороток по перекрестности, титру, качеству преципитационных зон. Недостатком видится эквивалентное право использования всех антигенов – вирусных штаммов, используемых для получения вакцины, в том числе реассортантов. Необходимость ускорения гармонизации требований Европейской и Американской Фармакопей/CBER к методу рассчета специфической активности, либо методом паралелльных линий, либо методом отношений углов наклонов. Отсутствует официальный СОП с включением типа используемого геля агарозы (прозрачность/адгезивность/гомогенность/толщина геля, отсутствие пузырьков воздуха),  типа подложки для геля,  метода статистики, метода обсчета, каталожных номеров реагентов, дизайна платы для геля, каталожных номеров оборудования для нанесения пробы в гель и обсчета иммунодиффузионных колец  (инструмента для измерения колец) и т д.

Многие из вышеуказанных проблемных вопросов были сняты международными экспертами в недавней публикации Wood J. M.,. Weir J. P. (36) со ссылками на международные совместные исследования.  Главное в ней,  что в случае пандемичной ситуации появляется возможность исключения абсолютной зависимости от наличия гомологичной антисыворотки за счет использования имеющихся в наличии перекрестно-реагирующих антисывороток (55),  что существенно облегчает трудную жизнь производителей вакцин против гриппа.  Поэтому не смотря на незначительную критику уже 40 лет метод ОРИД живет и здравствует и остается пока единственным официально разрешенным/лицензированным методом оценки специфической активности гемагглютинина в инактивированных гриппозных вакцинах.