Выявление маркеров вируса гепатита С - белка нуклеокапсида, РНК и вирусспецифических антител в плазмах крови доноров

, , *, *,

, ,

Выявление маркеров вируса гепатита С - белка нуклеокапсида, РНК и вирусспецифических антител в плазмах крови доноров.

Институт вирусологии им. РАМН, Москва;

* Гематологический научный центр РАМН, Москва

Специфическая диагностика гепатита С (ВГС) основывается главным образом на обнаружении серологических маркеров инфекции - вирусспецифических антител. С использованием рекомбинантных белков и синтетических пептидов, имитирующих последовательности структурных и неструктурных белков вируса и отдельные антигенные детерминанты, разработаны скринирующие тесты на основе иммуноферментного анализа (ИФА) и подтверждающие тесты на основе иммуноблота. Одних серологических тестов, однако, недостаточно для надежной диагностики: при первичной инфекции появление антител задерживается [9, 11]; до 10% больных с подтвержденной инфекцией остаются серонегативными [15]. С другой стороны, обнаружение антител не всегда свидетельствует об активной вирусной репликации [9, 11, 15]. В последнее время все шире внедряется метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) для выявления РНК ВГС. Этот метод обладает высокой чувствительностью, однако сложен и дорогостоящ. Это в особенности относится к количественному варианту ПЦР. Кроме того, результаты, полученные в разных лабораториях, весьма широко варьируют. Коммерчески доступные тесты для прямой детекции белков ВГС в сыворотках отсутствуют. Их разработка затруднена по двум основным причинам: из-за низкой концентрации вируса и блокирования вируса антителами в составе иммунных комплексов [8, 13, 14].

Ранее мы получили моноклональные антитела (МКА) к антигенным детерминантам рекомбинантного белка нуклеокапсида ВГС (core) и показали, что эти МКА опознают эпитопы нативного белка [1]. На основании МКА были разработаны основные методические подходы для количественной детекции core-белка в сыворотках крови [5]. Цель настоящей работы состояла в сравнительном изучении core-белка и других маркеров ВГС - РНК и антител в плазмах доноров крови.

Материалы и методы

Моноклональные антитела. Получение и свойства МКА к рекомбинантному белку нуклеокапсида (R150) описаны ранее [1]. МКА опознают 4 неперекрывающихся детерминанты (МКА 27 и 37 - на N-конце, МКА D4 и G7 - на C-конце молекулы) и взаимодействуют с нативным вирусным белком [5]. МКА получали из асцитических жидкостей мышей и очищали с помощью аффинной хроматографии на колонке с Protein A - Sepharose CL-4B (Pharmacia) по методу, рекомендованному фирмой. Конъюгацию МКА с пероксидазой хрена выполняли модифицированным перийодатным методом как описано ранее [1].

Плазмы крови доноров. Плазмы (n=80), содержащие антитела к ВГС (анти-ВГС) получены в 1995-1996 г. г. на Станции переливания крови при Гематологическом научном центре РАМН от добровольных доноров. Анти-ВГС выявляли с помощью скринирующих тест-систем "Диагностические системы" (г. Нижний Новгород) и "РекомбиБест" (г. Новосибирск). Отбирали образцы с оптической плотностью в ИФА больше 1, 0. Во всех плазмах определяли также титр антител класса IgG к белку core c помощью непрямого ИФА при сорбции на твердую фазу R150 в концентрации 0,5 мкг/мл. В качестве отрицательного контроля использовали 7 плазм, не содержащих анти-ВГС антител.

Подготовка плазм для детекции core-белка ВГС. Плазмы доноров в объеме 15 или 60 мл центрифугировали при 3500 g 15 мин. и затем ультрацентрифугировали при 143000 g в течение 3 час. при 40 С (ультрацентрифуга Sorvall OTD 65, Du Pont, США). Осадки ресуспендировали в 20 мМ трис-НСl буфере, pH 7,4, содержащем 0,15 М NaCl, до конечного объема 0,3 мл и подвергали обработкам, описанным в разделе "Результаты".

Определение антигенной активности белка нуклеокапсида проводили с помощью сэндвич-варианта ИФА. Для этого смесь четырех МКА (27, 37, D4 и G7) сорбировали в лунки панелей ( Nunc, Дания) в концентрации 10 мкг/мл в 0,1 М фосфатно-солевом буфере (PBS) pH 7,4 в течение ночи при комнатной температуре, затем в течение 1 часа блокировали неспецифические участки связывания 10% пуповинной сывороткой человека в PBS. После промывки панелей PBS с 0,1% твин-20 (PBST) проводили инкубацию с образцами (2 часа, 370 С), промывали  и на 1 час добавляли раствор конъюгата - МКА 27, меченные пероксидазой, в блокирующем буфере. Выявление ферментативной активности пероксидазы проводили стандартным методом с использованием ортофенилендиамина (ОФД) в качестве субстрата. Содержание белка нуклеокапсида в образцах оценивали по калибровочной кривой с рекомбинантным белком R150, для которого предварительно была показана линейная зависимость оптической плотности (ОП) от концентрации в диапазоне 1-130 нг/мл.

Определение РНК ВГС проводили с помощью "nested"-варианта ПЦР (RT-PCR) с использованием синтетических праймеров из 5'-нетранслируемого региона ВГС [6]. Определение генотипов ВГС проводили согласно методу [7].

Статистический анализ. Вычисляли средние значения и ошибки средних значений для различных параметров (концентрация core-белка в плазмах, активность антител). Различия между группами считали статистически достоверными при Р < 0, 05 по критерию Стьюдента.

Результаты

При исследовании 80 анти-ВГС-позитивных плазм только в половине (49%) из них выявлена РНК ВГС ( Табл. 1 ). В большинстве образцов определен генотип 1b (86%), остальные - имели генотип 3a. Активность взаимодействия антител с рекомбинантными антигенами - компонентами структурных и неструктурных белков ВГС в составе скринирующих тест-систем, в среднем, не различались между группами РНК-позитивных и РНК-негативных плазм. Антитела к белку нуклеокапсида выявлялись в более высоких концентрациях среди РНК-позитивных плазм (различия между средними значениями  статистически достоверны, Р < 0,05), однако значения активности колебались в широких пределах. В обеих группах выявлены плазмы с повышенным уровнем фермента аланинаминотрасферазы (АЛТ), что характерно для различных заболеваний печени, в том числе и для вирусных гепатитов.

45 образцов анти-ВГС-позитивных плазм, 36 из которых содержали РНК ВГС, были подвергнуты ультрацентрифугированию и исследованы на содержание core-белка. Были изучены также  7 образцов плазм, негативных по антителам к ВГС и РНК. Каждый осадок делили на 3 части (объемом по 100 мкл) и анализировали в ИФА без дополнительной обработки (одну часть), после обработки твином-80 до конечной концентрации 0,5% (вторую часть) и после обработки твином-80 в сочетании с 2, 5 М KBr (третью часть).

Проводя описанные выше обработки, мы полагали, что сигнал в ИФА с необработанными осадками свидетельствует о присутствии свободных нуклеокапсидов. Добавление к осадку неионного детергента приводит к разрушению липидного бислоя и позволяет выявлять core-белок в составе вирионов. Действие высокой ионной силы, создаваемой KBr, в сочетании с детергентом диссоциирует иммунные комплексы вирионов и/или нуклеокапсидов со специфическими антителами, что позволяет определить активность core-белка в осадках. По относительной интенсивности получаемых сигналов в ИФА мы судили о преимущественном содержании вирионов, свободных нуклеокапсидов и иммунных комплексов в каждой плазме. Согласно этому принципу исследованные плазмы были разделены на несколько условных групп (Табл. 2):

I. Активность белка нуклеокапсида обнаружена только после обработки осадков твин-80, что указывает на преимущественное содержание вирионов в этих плазмах (3 образца);

II. Сore-белок выявлен после обработки осадков детергентом, после диссоциации иммунных комплексов сигнал в ИФА увеличивался. Это позволяет предположить социркуляцию вирионов и иммунных комплексов в плазмах этих доноров (4 образца).

III. Позитивный сигнал в 15 плазмах был выявлен только после обработки осадков KBr с твин-80, что свидетельствует, повидимому, о циркуляции в крови иммунных комплексов.

IV. Сore-белок обнаружен в необработанных осадках (6 образцов). Воздействие детергента и высокой концентрации соли не увеличивало детекцию белка. Эти данные указывают на присутствие в крови доноров свободных нуклеокапсидов, циркулирующих без липидной оболочки и поверхностных белков.

V. В 6 плазмах активность core-белка также была выявлена в необработанных осадках. Добавление детергента не приводило к увеличению сигнала. В то же время при действии KBr детекция антигена значительно увеличивалась.  Можно предположить, что в этих плазмах циркулируют как свободные нуклеокапсиды, так и находящиеся в составе иммунных комплексов.

VI. В 10 плазмах белок нуклеокапсида не обнаружен.

Чувствительность выявления core-белка в осадках составляла 1 нг/мл. Первоначально все плазмы центрифугировали в объеме 15 мл. Если активность белка нуклеокапсида не выявлялась, осаждение вирусных частиц проводили из большего объема плазмы - 60 мл. Таким образом, в пересчете на исходный объем плазм чувствительность детекции core-белка составляла 5 пг/мл или 20 пг/мл. Отметим, что в низкой концентрации (5-10 пг/мл) core-белок был обнаружен только в 4 плазмах. Данные о концентрации белка нуклеокапсида, о присутствии РНК ВГС и об активности антител класса IgG к белку нуклеокапсида приведены в Табл. 2.

Количество белка нуклеокапсида сильно варьировало во всех группах. Наибольшее содержание core-белка - 850 пг/мл, обнаружено в плазме из V группы, минимальное - 5 пг/мл, в двух образцах: из I и III групп.

Белок нуклеокапсида выявлен почти исключительно в РНК-позитивных плазмах с генотипом ВГС как 1b, так и 3a. Лишь в одном образце из V группы при отсутствии РНК обнаружен core-белок в составе свободных нуклеокапсидов и в более высокой концентрации - в составе иммунных комплексов. Интересно, что в этом образце активность циркулирующих  антител к core-белку была значительно ниже среднего уровня (титр в ИФА с R150 - 1:200). В двух РНК-позитивных плазмах белок нуклеокапсида не обнаружен. Восемь анти-ВГС-позитивных образцов не содержали ни вирусного генома, ни core-белка.

Активность суммарных анти-ВГС антител не различалась между группами (результаты не показаны). При анализе антител к core-белку (Табл. 2) разница между некоторыми группами была более существенной. Так, наибольший титр анти-core антител обнаружен в группе II (вирионы и иммунные комплексы), наименьший - в группе I (вирионы). Статистически достоверное превышение активности антител к белку нуклеокапсида показано для групп II, III и IV по сравнению с группой I.

Плазмы 7 доноров, взятые в качестве отрицательного контроля, не содержали ни одного из исследованных маркеров ВГС.

Обсуждение

Известно, что МКА, полученные к рекомбинантным белкам ВГС, не всегда опознают антигены в составе вируса [2, 16]. МКА, использованные в нашем исследовании, взаимодействовали с натуральным белком нуклеокапсида по крайней мере двух генотипов ВГС - 1b и 3a, что свидетельствует о консервативности эпитопов, взаимодействующих с этими антителами. Максимальная чувствительность выявления рекомбинантного белка нуклеокапсида получена при использовании двух МКА (D4 и 27) для конструирования сэндвич-варианта ИФА [1], тогда как оптимальная детекция натурального антигена достигалась при сорбции четырех МКА разной специфичности [5]. Наиболее важным является включение в состав сэндвича как в качестве улавливающих, так и в качестве детектирующих антител МКА 27, опознающих эпитоп в N-конце молекулы белка нуклеокапсида. Вероятно, этот участок наиболее экспонирован и/или является иммунодоминантным.

Серьезной проблемой является присутствие в сыворотках анти-ВГС-позитивных лиц антител к белку нуклеокапсида, которые могут ингибировать или блокировать его детекцию [8, 13, 14]. Использование высокой концентрации KBr в сочетании с неионным детергентом твин-80 было выбрано как наиболее эффективное из более чем 20 экспериментально апробированных нами способов дезинтеграции иммунных комплексов [5]. Этот подход позволил выявить core-белок в 15 образцах плазм, в которых он был полностью блокирован антителами, а также еще в 11 образцах, в которых иммунные комплексы социркулировали с вирионами и свободными нуклеокапсидами. Дифференциальная детекция белка нуклеокапсида в составе различных популяций вирусных частиц представляется нам особенно перспективной в связи с полученными данными о корреляции между различными стадиями заболевания гепатитом С и относительным соотношением вирионов и иммунных комплексов в сыворотках пациентов [4, 10]. Иммунные комплексы, в частности, ассоциируются с меньшей инфекционностью вируса in vivo и in vitro, повидимому, из-за иммунологической нейтрализации ВГС антителами [4, 12].

Выявление core-белка совпадало с наличием РНК ВГС в плазмах анти-ВГС-позитивных доноров: 34 из 36 РНК-позитивных образцов содержали и белок нуклеокапсида. В двух РНК-позитивных плазмах белок нуклеокапсида не обнаружен, что может свидетельствовать либо об отсутствии экспрессии вирусного генома, либо о следовых количествах вируса в этих плазмах (< 5пг/мл). С другой стороны, core-белок был выявлен в одной РНК-негативной плазме, где он находился, в основном, в составе иммунных комплексов. Можно предположить, что в данном случае core-белок входил в состав дефектных вирусных частиц, не содержащих РНК.

Большим преимуществом разработанной методики является возможность количественного анализа core-белка в сыворотках. О важности определения этого параметра свидетельствуют исследования, в которых показано, что концентрация сore-белка в сыворотках пациентов является самостоятельным прогностическим критерием при оценке эффективности лечения интерфероном [13]. Японские исследователи показали, что концентрация core-белка 20 пг/мл (предельная чувствительность определения в их работе) соответствует концентрации РНК ВГС около 104 копий/мл [8]. В нашем исследовании лишь в 4 плазмах из 45 core-белок содержался в концентрации 5-10 пг/мл, в подавляющем большинстве образцов его концентрация превышала 20 пг/мл. плазм. В настоящее время для надежного выявления белка нуклеокапсида в образцах крови доноров требуется 15-60 мл плазмы. Предварительные данные  опытов, направленных на повышение чувствительности ИФА и на разработку альтернативных способов концентрирования вируссодержащего материала, указывают на возможность определять белок нуклеокапсида в осадках, полученных из 3-5 мл плазмы крови.

Суммируя полученные данные, можно констатировать, что такие маркеры ВГС-инфекции, как активность антител к ВГС и уровень фермента АЛТ в анти-ВГС – позитивных плазмах доноров не могут свидетельствовать о присутствии в них инфекционного агента - ВГС. Так, только половина из 80 изученных нами образцов анти-ВГС-позитивных плазм доноров содержали РНК ВГС. В большинстве образцов определен генотип 1b. Эти данные согласуются с результатами молекулярно-эпидемиологических исследований, показавших преобладание генотипа ВГС 1b на европейской территории России [4]. В 94,4% РНК-позитивных плазм выявлен и белок нуклеокапсида ВГС. Таким образом, отсутствие РНК и белка ВГС в приблизительно 50% всех изученных плазм с большой вероятностью свидетельствует об отсутствии активной репликации ВГС по крайней мере  у половины серопозитивных доноров в момент забора крови. Такие плазмы, не содержащие ВГС, могли бы использоваться службой крови.

На основании полученных данных можно сделать вывод о том, что количественное определение белка нуклеокапсида в плазмах ВГС-инфицированных лиц в составе разных популяций вирусных частиц представляется важным как с практической, так и с теоретической точки зрения - для раскрытия механизма патогенеза  гепатита С.

Работа выполнена при частичной поддержке РФФИ, грант 98-04-48307.

РЕЗЮМЕ

Проведено сравнительное изучение маркеров вируса гепатита С (ВГС): белка нуклеокапсида (кор-белка), РНК и вирусспецифических антител, в плазмах 80 доноров. Для количественного определения кор-белка разработан метод на основе сэндвич-варианта ИФА с использованием моноклональных антител к рекомбинантному белку. Белок нуклеокапсида выявляли после различных обработок осадков, полученных после концентрирования вируссодержащих материалов из плазм. Эти обработки позволяли дифференцировать кор-белок в составе вирионов, свободных нуклеокапсидов и иммунных комплексов, циркулирующих в периферической крови. Минимальная концентрация кор-белка, обнаруженная нами, составляла 5 пг/мл, максимальная - 850 пг/мл. Выявление кор-белка практически совпадало с наличием РНК ВГС: 94,4% РНК-позитивных образцов содержали и вирусный белок. Остальные параметры (активность антител к ВГС в ИФА, уровень фермента АЛТ) не позволяли дифференцировать плазмы по наличию активно реплицирующего вируса. Количественное определение белка нуклеокапсида в плазмах ВГС-инфицированных лиц в составе различных популяций вирусных частиц представляется важным как с практической стороны - для службы крови, так и с теоретической точки зрения - для изучения механизма вирусного патогенеза.

Ключевые слова: вирус гепатита С (ВГС), белок нуклеокапсида ВГС, моноклональные  антитела, РНК ВГС, антитела к ВГС.

A comparative study of hepatitis C virus (HCV) markers (nucleocapsid protein, RNA, and HCV-specific antibodies) was carried out on 80 donor plasmas containing anti-HCV antibodies (anti-HCV). A method for quantitative determination of nucleocapsid (core) protein was developed on the basis of the EIA-sandwich variant using monoclonal antibodies to the recombinant core-protein. Different treatments of pellets obtained after concentration of virus-containing materials from blood plasmas were used to reveal core-protein. These treatments made possible differentiation of nucleocapsid protein within virions, free nucleocapsids and immune complexes circulating in peripheral blood of donors. Minimal concentration of core-protein detected in blood plasma was 5 pg/ml, maximal – 850 pg/ml. Detection of core-protein practically coincided with the presence of HCV RNA: 94,4% of RNA-positive samples contained virus protein. The activity of anti-HCV in EIA and ALT level did not allow plasma differentiation by the presence of the actively replicated virus. Quantitative determination of core-protein in blood plasmas of HCV-infected persons seems to be important both for practical use – in the blood service, and from theoretical point of view – for studying mechanism of HCV pathogenesis.

Key words: hepatitis C virus (HCV), HCV nucleocapsid protein, monoclonal antibodies, HCV RNA, anti-HCV antibodies.

Таблица 1

Характеристика анти-ВГС-позитивных плазм доноров

Параметры	РНК-положительные плазмы (n=39)	РНК-отрицательные плазмы (n=41)
генотип ВГС	1b: 25/29 (86%) 3a: 4/29 (14%)
активность суммарных антител к ВГС*	1,7 ± 0,048х (1,1 - 2,5)хх	1,6 ± 0,062 (1,2 - 2,4)
активность антител к белку нуклеокапсида**	3600 ± 112 (100 – 12800)	2400 ± 31 (200 - 6400)
количество плазм с повышенным уровнем АЛТ	5	6
количество плазм, содержащих белок нуклеокапсида	34/36	1/9

* ОП при разведении 1:10 в скринирующих тестах ИФА

** обратный титр с R150 в ИФА

х средние значения ±  ошибка среднего значения

хх в скобках приведены минимальные и максимальные значения параметров

Таблица 2

Детекция белка нуклеокапсида ВГС в анти-ВГС-позитивных плазмах доноров в составе различных популяций вирусных частиц

Группа плазм	Преимущест-венная форма циркуляции частиц ВГС*	Кол-во образцов	Кол-во РНК-позитивных плазм	Концентрация белка нуклеокапсида (пг/мл)	Активность антител к белку нуклеокапсида (обратный титр)
I	вирионы	3	3	58±29**	900±58
II	вирионы и иммунные компл.	4	4	285±52	8800±1300
III	иммунные компл.	15	15	234±13	2700±154
IV	нуклеокапсиды	6	6	185±16	5000±694
V	нуклеокапсиды и имм. компл.	7	6	452±42	3300±567
VI	белок нуклеокапсида не выявлен	10	2	0	2500±348

* cм. объяснения в тексте

** среднее значение ±  ошибка среднего значения