Скрининг врожденной дисфункции коры надпочечников: причины и следствия ошибок метода (стр. 1 )

На правах рукописи

ШАЙТАРОВА

Анна Владимировна

СКРИНИНГ ВРОЖДЕННОЙ
ДИСФУНКЦИИ КОРЫ НАДПОЧЕЧНИКОВ:
ПРИЧИНЫ И СЛЕДСТВИЯ ОШИБОК МЕТОДА

14.01.08 – педиатрия
14.01.02 – эндокринология

АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук

Тюмень – 2011

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном
учреждении высшего профессионального образования
«Тюменская государственная медицинская академия»
Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научные руководители:

Доктор медицинских наук

Доктор медицинских наук,
профессор

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук,
профессор

ГБОУ ВПО «Тюменская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Доктор медицинских наук,
профессор

ГБОУ ВПО Первый Московский государственный университет им. Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Уральская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России

Защита состоится 1 февраля 2012 г. в 9 часов на заседании диссертационного совета Д 208.101.01 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Тюменская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО ТюмГМА Минздравсоцразвития России.

Автореферат разослан 29 декабря 2011 года.

Ученый секретарь
диссертационного совета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ

Актуальность темы. Врожденная дисфункция коры надпочечников соответствует условиям включения в программу неонатального скрининга, поскольку является распространенным, потенциально летальным заболеванием и может быть диагностирована простым гормональным анализом – исследованием уровня 17-гидроксипрогестерона в крови. Распространенность классических форм врожденной дисфункции коры надпочечников (ВДКН) в общей Европейской популяции составляет 1:14 199 новорожденных (Bryant K. G., 2004),частота заболевания в Российской популяции новорожденных до настоящего времени не установлена. Опыт, накопленный за годы проведения скрининга, позволил выявить ряд проблем, наиболее актуальной из них является наличие ложноположительных результатов теста, что снижает прогностическую ценность метода и повышает экономические затраты. До настоящего времени недостаточно изучены факторы, влияющие на возникновение ложноположительных результатов метода.

В последнее время значительно возрос интерес к неклассическим формам ВДКН ввиду их более высокой распространенности в общей популяции 1:1000 (White P. C., 2000; New M. I., 2006) и негативного влияния на репродуктивное здоровье женщин. С 2002 года в ряде территорий РФ, в том числе и Тюменской области, был внедрен селективный скрининг беременных женщин на неклассическую форму ВДКН. В связи с отсутствием разработанных нормативов маркеров адреналовой гиперандрогении с учетом их метаболизма в период гестации и неверной интерпретацией результатов теста, возникла проблема гипердиагностики неклассической формы ВДКН у беременных женщин и широкого применения глюкокортикоидов на ранних сроках гестации. Основанием для подобной терапевтической тактики является приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 01.01.01 года № 50 «О совершенствовании акушерско-гинекологической помощи в амбулаторно-поликлинических учреждениях», действующий до настоящего времени.

Безопасность применения синтетических глюкокортикоидов у беременных в последнее время является предметом активных дискуссий ввиду их возможных неблагоприятных эффектов на плод и здоровье ребенка. Результаты исследований свидетельствуют о возможности программирования гипоталамо-гипофизарно-адреналовой системы плода под влиянием глюкокортикоидов, что связано с повышенным риском развития метаболических и сердечно-сосудистых нарушений, изменением поведения в последующем (Uno H., 1994; Sloboda D. M., 2002; Barker D. J., 2002; Seckl J. R., 2004; de Vries A., 2007; Kapoor A., 2007). Кроме того, механизм онтогенетического программирования, очевидно, может иметь адаптивную эволюционно-генетическую основу и способен обеспечить передачу эффекта неблагоприятного воздействия, перенесенного предками, в ряду поколений (Drake A. J., 2004; Meaney M. J., 2007).

Таким образом, необходимость предотвращения репродуктивных потерь в ранние сроки гестации, профилактика осложнений течения беременности, забота о рождении здорового ребенка требует от современной эндокринологии усовершенствования методов диагностики различных форм ВДКН, выбора оптимального и безопасного метода терапевтической коррекции заболевания. В связи с этим изучение эффективности массового неонатального скрининга и селективного скрининга у беременных в диагностике классических и неклассических форм ВДКН, а так же эффективности и безопасности глюкокортикоидной терапии, проводимой у женщин с повышенным уровнем маркеров адреналовой гиперандрогении представляется важным и актуальным.

Цель исследования. Определить значимость различных программ скрининга в диагностике классической и неклассической формы врожденной дисфункции коры надпочечников, а так же изучить возможные отсроченные эффекты применения глюкокортикоидов у беременных на здоровье детей раннего и младшего школьного возраста.

Задачи исследования

1. Изучить эффективность метода неонатального скрининга в выявлении дефицита 21-гидроксилазы в популяции новорожденных г. Тюмени.

2. Оценить диагностическую значимость определения 17-ОНП и ДГЭА-С в крови при проведении селективного скрининга неклассических форм ВДКН беременных женщин.

3. Определить факторы, оказывающие влияние на транзиторное повышение концентрации 17-гидроксипрогестерона при проведении скрининга дефицита фермента 21-гидроксилазы у доношенных новорожденных.

4. Изучить особенности физического развития детей раннего и младшего школьного возраста от матерей, получавших дексаметазон во время беременности.

5. Исследовать возможные эффекты применения дексаметазона у беременных на нервно – психическое и интеллектуальное развитие их детей в раннем и младшем школьном возрасте, а так же влияние дозы, продолжительности курса и сроков начала применения дексаметазона на характер этих эффектов.

Научная новизна. Впервые изучены эпидемиологические характеристики ВДКН по результатам массового скрининга у новорожденных Тюмени, установлена ее высокая распространенность.

Установлена высокая эффективность, специфичность, но низкая чувствительность метода определения 17-гидроксипрогестерона в крови при проведении массового скрининга новорожденных для выявления ВДКН.

Впервые установлено определяющее влияние на транзиторное повышение уровня 17-гидроксипрогестерона у доношенных детей таких патологических состояний беременности, как гестозы, фето-плацентарная недостаточность, внутриутробная гипоксия плода.

Впервые проведен сравнительный анализ частоты транзиторного повышения 17-ОНП у доношенных новорожденных в зависимости от срока гестации, в котором развивалось патологическое состояние беременности. Показано влияние развития патологии беременности в критические периоды формирования гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы плода на частоту транзиторного повышения уровня 17-ОНП у доношенных детей.

Показано отсутствие эффективности применения глюкокортикоидов у беременных с целью профилактики репродуктивных потерь и негативное влияние антенатальной глюкокортикоидной терапии на здоровье детей.

Впервые проведено лонгитудинальное проспективное исследование физического, нервно-психического и интеллектуального развития детей, матери которых принимали дексаметазон во время беременности. Установлены неблагоприятные эффекты антенатального применения глюкокортикоидов на физическое развитие детей в младшем школьном возрасте. Выявлены особенности состояния когнитивных функций у детей младшего школьного возраста, установлена их зависимость от срока начала применения дексаметазона.

Практическая значимость. Доказана высокая эффективность метода массового скрининга новорожденных для ранней диагностики ВДКН. Обоснована возможность применения скрининга для определения распространенности недостаточности 21-гидроксилазы в популяции новорожденных.

Выявлены причины, приводящие к ложноположительным результатам неонатального скрининга, что позволило разработать подходы, позволяющие повысить положительную прогностическую значимость скрининга, уменьшить экономические и временные затраты данного метода исследования.

Установлено, что метод селективного скрининга беременных женщина на неклассическую форму дефицита фермента 21-гидроксилазы с использованием показателей 17-ОНП и ДГЭА-С в крови обладает низкой эффективностью для диагностики заболевания и не позволяет оценить истинную распространенность врожденной ферментопатии у беременных

Доказана неэффективность применения глюкокортикоидов у беременных женщин с повышенным уровнем маркеров адреналовой гиперандрогении в оптимизации репродуктивного прогноза. Установлены отсроченные негативные эффекты применения дексаметазона у беременных на физическое и интеллектуальное развитие детей в младшем школьном возрасте. Выявлена прямая зависимость между проявлениями негативных эффектов на познавательные способности у детей в младшем школьном возрасте и сроком начала терапии глюкокортикоидной терапии у беременных.

Положения, выносимые на защиту

1. Массовый неонатальный скрининг дефицита 21-гидроксилазы является эффективным методом доклинической диагностики заболевания и оптимальной моделью для определения истинной распространенности врожденной ферментопатии в детской популяции.

2. Использование глюкокортикоидной терапии у беременных женщин с высокой концентрацией биохимических маркеров адреналовой гиперандрогении приводит к неблагоприятным отсроченным эффектам на физическое и интеллектуальное развитие детей в младшем школьном возрасте: выраженной дисгармоничности физического развития за счет увеличения частоты избытка массы тела и ожирения; снижению показателей когнитивных функций.

3. Применение дексаметазона у беременных женщин в ранние сроки гестации может привести к значимым негативным эффектам на интеллектуальные способности у детей в последующем: снижению уровня речевого развития, вербально-логического мышления, сформированности произвольного внимания и способности организации, регуляции деятельности.

Апробация результатов исследования. Материалы диссертации представлены на Зимней Школе Европейского Общества Детских Эндокринологов (Москва, март 2009 г.); на конференции Союза педиатров России (Ханты-Мансийск, апрель 2010 г.); на областной научно-практической конференции «Актуальные вопросы педиатрии и неврологии раннего возраста» (Тюмень, апрель 2010 г.); на VI терапевтическом форуме «Актуальные вопросы диагностики и лечения наиболее распространенных заболеваний внутренних органов» в рамках симпозиума «Новое в диагностике и лечении эндокринных заболеваний» (Тюмень, ноябрь 2011 г.).

Внедрение результатов работы. Результаты исследования внедрены в работу лаборатории биохимической генетики медико-генетической консультации ГБУЗ ТО «Перинатальный центр» (зав. консультации ); детских лечебно-профилактических учреждений города. Используются в учебно-педагогической работе кафедр педиатрии и терапии ФПК и ППС с курсом эндокринологии ГБОУ ВПО Тюменская Государственная медицинская академия Минздравсоцразвития России.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ в центральной и местной печати, в том числе 3 статьи в рецензируемых ВАК журналах.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, четырех глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, библиографии, включающей 53 отечественных и 116 зарубежных источников. Работа изложена на 131 странице машинописного текста, содержит 22 таблицы и 18 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Первый этап – анализ массового скрининга классической формы дефицита 21-гидроксилазы в популяции новорожденных г. Тюмени. За 20гг. обследовано 64199 новорожденных. На 4 день жизни у доношенных (7 день жизни у недоношенных) новорожденных в родильном доме или в детской поликлинике производился забор капиллярной крови из пятки с нанесением на пористую фильтровальную бумагу Schleicher and Schuell SqS 2992. Полученные образцы доставлялись в лабораторию биохимической генетики медико-генетической консультации, где проводилось определение уровня неонатального 17-ОНП. За пороговый уровень у доношенных новорожденных (срок гестации > 36 недель, вес > 2500 гр.) принимали значения 17-ОНП в сухом пятне крови - 30 нмоль/л, у недоношенных при сроке гестации 33-36 недель (масса тела при рождении < 2500 гр.нмоль/л, у недоношенных при сроке гестации 23-32 недели – 150 нмоль/л. В ходе исследования была выявлена группа детей с повышенным уровнем неонатального 17-ОНП по результатам первого этапа скрининга и недостаточным его снижением после проведения ретестирования, у матерей которых не было установлено каких-либо осложнений течения беременности или родов, соматической патологии. С целью исключения неклассической формы врожденной дисфункции коры надпочечников в данной группе детей проведено молекулярно-генетическое исследование для выявления наиболее часто встречающихся мутаций в гене CYP-21.

Для проведения анализа причин транзиторного повышения уровня 17-ОНП у доношенных детей была сформирована группа из 50 детей, родившихся в сроке с 37 по 41 неделю гестации, у которых было зафиксировано повышение уровня 17-ОНП более 30 нмоль/л на первом этапе скрининга и его нормальные значения после проведения ретеста (менее 30 нмоль/л). Группу контроля составили 50 доношенных детей с массой тела > 2500 гр. и нормальными значениями 17-ОНП по результатам скрининга, отобранные методом случайной выборки. В обеих группах проведен ретроспективный анализ особенностей течения гестационного периода и родов, раннего неонатального периода.

Проведена оценка диагностической ценности метода неонатального скрининга: рассчитаны эффективность, чувствительность, специфичность и прогностическая значимость.

Второй этап - анализ селективного скрининга неклассической формы врожденной дисфункции коры надпочечников у беременных женщин, имеющих отягощенный репродуктивный анамнез и риск невынашивания. Обследование беременных проводилось методом определения уровней ДГЭА-С и 17-ОНП в сыворотке крови на основании рекомендаций кафедры акушерства и гинекологии ГОУ ВПО ТюмГМА Росздрава, при поддержке Управления по здравоохранению г. Тюмень. Проведен ретроспективный анализкарт наблюдения беременных женщин и родильниц женских консультаций №1, 2, 3, 5 и Перинатального центра при «ТОЦОМ и Д». За период гг. уровень ДГЭА-С определен 3 869 женщинам. В случае его повышенного содержания при наличии угрозы прерывания беременности у женщин проводилось исследование уровня 17-ОНП (n=445). Проведена оценка значимости определения 17-ОНП и ДГЭА-С в крови для диагностики неклассических форм ВДКН у беременных, рассчитаны показатели специфичности, чувствительности и прогностической значимости метода. Изучены особенности течения беременностей и родов у 225 женщин, принимавших дексаметазон с целью профилактики репродуктивных потерь в соответствии с приказом МЗСР РФ от 01.01.2001 г №50.

Третий этап - проспективное, лонгитудинальное исследование особенностей физического, нервно-психического и интеллектуального развития 395 детей, в том числе 288 детей (основная группа) от матерей с адреналовой гиперандрогенией, которые принимали дексаметазон во время беременности с целью профилактики репродуктивных потерь и 107 детей (контрольная группа) от матерей с высокими биохимическими маркерами адреналовой гиперандрогении, которые дексаметазон не принимали. Последовательный набор детей основной группы проводили в Центре охраны здоровья детей ГБУЗ ТО «Областная клиническая больница №1» в соответствии с критериями включения: прием матерью дексаметазона в период беременности, наличие информированного согласия, подписанного родителем или опекуном. Критерии исключения: пубертатный период, органическое поражение ЦНС, ургентные состояния на момент обследования, отказ от участия в исследовании. За период с 2002 по 2011 гг. обследовано 114 детей первого года жизни, 58 детей второго года жизни (средний возраст 1,7 ± 0,7 года), 26 детей 3 года жизни (средний возраст 2,4±0,8 года), 90 детей в возрасте от 7 до 9 лет (средний возраст 7,8±0,94 года) основной группы. Группу контроля составили 57 детей раннего возраста и 50 детей младшего школьного возраста. Группа контроля была подобрана методом паракопий по данным гинекологического, акушерского анамнеза матерей, особенностям течения беременностей. По сроку гестации при рождении, полу и возрасту детей на момент проведения исследования различий в основной и контрольной группах также не отмечалось (р > 0,05). Ретроспективный анализ карт наблюдения беременных показал, что средняя суточная доза дексаметазона у беременных составила 2,44±1,17 мкг/кг массы тела, а продолжительность курса глюкокортикоидной терапии варьировала от 6 до 24 недель (22,8±1,6 недель). Методы исследования

Первый этап – определение уровня 17-гидроксипрогестерона в капиллярной крови новорожденных методом флюорометрического иммуноферментного анализа с использованием стандартных наборов «17-OНP - Neonatal» («Delfia», Финляндия) на оборудовании фирмы «Wallac» (Финляндия) в лаборатории биохимической генетики медико-генетической консультации ГБУЗ ТО «Перинатальный центр» (заведующая консультацией ).

Детекция мутаций в гене CYP21 у детей с повышением 17-ОНП по результатам первого этапа скрининга и недостаточным его снижением по результатам ретеста проведена по методике A. Wedell и H. Luthman с модификациями в лаборатории генетики и клинической иммунологии ФГУ Эндокринологического научного центра Минздравсоцразвития России г. Москва (заведующий лабораторией д. м.н., проф. ).

Второй этап - гормональное исследование у беременных женщин проводилось в лаборатории Тюменского областного центра охраны материнства и детства (главный врач ) с использованием анализатора фотометрического ИФА (Multiscan, Labsistems, Финляндия).

Реактивы для определения дегидроэпиандростерон-сульфата – DHEA-S ELISA, DRG Instruments Gmbh, Германия (рекомендуемая норма для беременных женщин 0,2-1,2 мкг/мл). Для определения 17-гидроксипрогестерона использовались реактивы «DRG 17α-OH-Progesterone E 1A-1292», США (лабораторная норма в третьем триместре беременности 2,0-12,0 нг/мл).

Третий этап – у всех детей основной и контрольной групп проведен анализ генеалогического и биологического анамнеза.

Оценка физического развития детей проводилась на основании антропометрических показателей – длины и массы тела. Измерение роста проводилось на ростомере Харпендера (производитель фирма’’Holstain Ltd., Crymych, Dyfed’’) с точностью до 0,1 см. Показатели роста и массы тела сравнивали с данными перцентильных таблиц роста и веса, разработанные Центром по контролю заболеваемости США, 2000 г.

Оценка нервно-психического развития детей раннего возраста осуществлялась методом определения усредненных индексов развития (ИРср) для каждой психоневрологической функции по методике , ИРср у здоровых детей > 1,0. Значение ИРср функции < 1,0 указывает на задержку темпов ее развития. Исследование особенностей интеллектуального развития у детей младшего школьного возраста проводилось с помощью детского варианта теста Векслера (Wechsler Intelligence Scale for Children, WISC) под редакцией , ; ИМАТОН 2006. Протокол проведения исследования соответствовал Хельсинской декларации (1975 г.) и ее пересмотренному варианту (1983 г.). При сборе материала соблюдались все необходимые условия для составления выборок: исследование проводилось в одно и то же время суток, при максимальном физическом и психическом покое испытуемых.

Методы статистического анализа. Количественные переменные обрабатывались методами описательной статистики (результаты представлены как среднее, стандартная ошибка среднего, среднеквадратичное отклонение, 5/95 перцентили). Количественные переменные в независимых группах сравнивали с помощью непарного t-критерия Стьюдента или критерия Манна-Уитни, в зависимости от распределения данных; качественные переменные – с помощью теста χ2 и точного теста Фишера. Для сравнения более двух независимых выборок – тест Краскала – Уоллиса. Анализ корреляций между переменными проводили по методу Спирмэна (r). Показатели р < 0,05 считались статистически значимыми.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

С 2003 по 2009 г. по программе неонатального скрининга на дефицит 21-гидроксилазы обследованы 64199 новорожденных, диагноз ВДКН был установлен у 7 детей. Средняя частота классических форм ВДКН в популяции новорожденных г. Тюмень по результатам неонатального скрининга составила 1:8837. Распространенность ВДКН в Тюменской популяции по показателям 2009 г. составила 8,37 на 100 000 детского населения. При распределении детей с ВДКН по полу соотношение мальчики: девочки в период до скрининга составило 1:1, после внедрения скрининга 3:1 соответственно. Эффективность используемого метода составила 99%, специфичность - 99%. Однако отмечена низкая чувствительность метода (77,8%) - у 2 доношенных девочек с вирильной формой заболевания зафиксированы ложно-отрицательные результаты теста. Из 20 011 новорожденных г. Тюмень, обследованных в рамках регионального пилотного проекта за гг., у 124 человек в первом тесте определен уровень 17-ОНП выше диагностического (60 нмоль/л). Доля ложноположительных результатов составила 0,62%. Из 44 188 новорожденных, обследованных в процессе реализации национальной программы неонатального скрининга на ВДКН с июня 2006 г. по декабрь 2009г., повышенный уровень 17-ОНП (более 30 нмоль/л) после первичного обследования выявлен у 493 (1,12%) обследованных (таб. 1).

Таблица 1

Результаты неонатального скрининга ВДКН в г. Тюмень гг.

Год	Проведено обследований	Число положительных тестов	Число больных ВДКН	Доля ложноположительных тестов (%)
	20011	124	2	0,62
2006	7573*	117	2	1,54
2007	11116	159	0	1,43
2008	12159	163	0	1,34
2009	13340	54	3	0,4
Всего	64199	617	7	0,96

Примечание: *- количество обследований, проведенных с 1.06.2006

В группе детей с ложноположительными результатами скрининга недоношенные новорожденные составили 62,9% (310 человек). Однако высокие концентрации 17-ОНП как в первом (36%), так и во втором тесте (45%) были отмечены и у доношенных детей без врожденной ферментопатии. По результатам молекулярно-генетического обследования методом аллельспецифической ПЦР в данной группе детей не выявлено наиболее часто встречающихся из известных мутаций гена CYP-21.

При изучении возможных причин транзиторного повышения неонатального 17-ОНП не установлено достоверных отличий в возрасте матерей к моменту рождения детей в основной и контрольной группе (26,4±4,3 лет и 27,06±0,43 лет соответственно, р = 0,2). Средний срок наступления родов у женщин основной группы составил 38,4±0,17 недель и не имел значимых отличий со сроком родов у женщин контрольной группы (р = 0,4). При оценке структуры репродуктивной патологии у матерей в исследуемых группах не установлено различий по частоте первичного бесплодия и нарушения менструального цикла (р=0,2; р=0,4). Соматические заболевания во время беременности отмечались с равной частотой у женщин в обеих группах (р = 0,6) и не оказывали значимого влияния на повышение неонатального 17-ОНП (r = -0,028; p=0,89). Особенности течения беременности и родов представлены в таб. 2.

Отягощенное течение беременности отмечалось у женщин как основной, так и контрольной групп. С равной частотой в исследуемых группах диагностированы угроза прерывания беременности (р=1,0). Достоверно чаще у беременных основной группы отмечались фето-плацентарная недостаточность (р=0,04), гестозы (р = 0,003). Установлено, что данные патологические состояния в основной группе значимо чаще определялись в критические периоды формирования гипоталамо-гипофизарной системы (ГГС) плода, т. е. в периоды дифференцировки (5-16 нед.) и становления нейросекреторной функции клеток фетальной гипоталамо-гипофизарной системы (32-34 нед.) (таб. 3).

Таблица 2

Особенности течения беременностей и родов у матерей в основной

и контрольной группах

Признак	Основная группа (n=50)	Контрольная группа (n=50)	р
абс.	%	абс.	%
Угроза прерывания беременности	14	28	14	28	1,0
Гестоз	21	42	4	8	0,003
Фето-плацентарная недостаточность	19	38	7	14	0,04
Прием дексаметазона	3	6	0	0	0,6
	Заболевания матери
Анемия	23	46	29	58	0,5
Острые респираторные заболевания	3	6	14	28	0,06
Ожирение	8	16	11	22	0,4
Сердечно-сосудистая патология	2	4	9	18	0,7
Заболевания почек	3	6	5	10	0,6
	Роды
Физиологические	32	64	25	50	0,8
Оперативные	7	14	9	18	0,3
Родостимуляция	6	12	9	18	0,5

Таблица 3