Клинико-лабораторные особенности острых кишечных инфекций, вызванных условно-патогенными энтеробактериями у детей и подростков

На правах рукописи

КЛИНИКО-ЛАБОРАТОРНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ОСТРЫХ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ, ВЫЗВАННЫХ УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫМИ ЭНТЕРОБАКТЕРИЯМИ У ДЕТЕЙ И ПОДРОСТКОВ

03.00.07 – микробиология

14.00.10 – инфекционные болезни

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Москва - 2006

Работа выполнена в Башкирском государственном медицинском университете (г. Уфа).

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

Ведущая организация: Государственное учреждение Научно-исследователь-ский институт вакцин и сывороток им. РАМН

Защита состоится «___» ______________2007 года, в 14 часов на заседании Диссертационного совета Д.208.040.08 в Московской медицинской академии им. по адресу: Москва, ул. Трубецкая, стр.2

С диссертацией можно ознакомиться в центральной научной медицинской библиотеке Московской медицинской академии им. ( Москва, Нахимовский пр., д.49).

Автореферат разослан «___» _____________2006 года.

Ученый секретарь

Диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Острые кишечные инфекции (ОКИ) в общей структуре детской инфекционной патологии остаются одной из основных проблем, занимая по частоте второе место после острых респираторных вирусных инфекций [, 2001]. Заболеваемость ОКИ в Российской Федерации за последние годы составила 414,,9 случаев на 100 тыс. населения и не имеет тенденции к снижению [, 2004]. При этом возрастает эпидемиологическая роль условно-патогенных микроорганизмов, в том числе энтеробактерий [, , 1999]. В структуре ОКИ у детей и подростков на долю заболеваний, вызванных условно-патогенными Enterobacteriaceae (УПЭ), приходится от 3,1% до 38,2% [ и др., 2003; , 1995; , 1991], а у детей первого года жизни – от 66,6% до 78,5% [, 1995; , 1989].

Относительно этиологической роли УПЭ при ОКИ мнение исследователей разноречивы [ и др., 1988; и др., 1988]. На современном этапе диагностика ОКИ, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, основывается на оценке клинических и лабораторных данных, включающих определение вида микроба и микробной обсемененности, однако, факт выделения УПЭ не всегда свидетельствует о его роли при данном заболевании [, , 2001]. В этой связи активно разрабатываются и совершенствуются методы оценки этиологической значимости данных микроорганизмов, в частности, через обнаружение мобильных генетических элементов (в т. ч. «островов» патогенности), с которыми связывают эволюцию условно-патогенных видов и появление патогенных клонов [, 2002; , 2001; и др., 2000].

Сведения об особенностях ответной реакции организма на внедрение УПЭ не многочисленны [Maaser C. et al., 2004; Higgins L. M. et al., 1999]. Научный и практический интерес представляет характеристика патогенетических возможностей УПЭ и сопряженных с ними иммунных реакций организма. Изучение продукции цитокинов и белков острой фазы позволяет установить особенности системной воспалительной реакции при острых кишечных инфекциях у детей и подростков, связанных с УПЭ.

Цель исследования

Оценить роль условно-патогенных микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae в развитии острых кишечных инфекций у детей и подростков на основании исследования генетических маркеров «островов» патогенности и их взаимосвязи с антибиотикорезистентностью выделенных штаммов, с ответной реакцией иммунной системы и с особенностями клинических проявлений заболеваний.

Задачи исследования

1.  Установить видовой состав условно-патогенных Enterobacteriaceae, выделяемых при острых кишечных инфекциях у детей и подростков, фенотипические особенности и антибиотикорезистентность клинических штаммов.

2.  Установить наличие и частоту встречаемости фрагментов генов «островов» патогенности у клинических штаммов условно-патогенных энтеробактерий, выделенных при острых кишечных инфекциях у детей и подростков. Определить характер взаимосвязи между наличием генов «островов» патогенности и антибиотикорезистентностью выделенных культур.

3.  Выявить особенности течения острых кишечных инфекций, вызванных условно-патогенными энтеробактериями, в различных возрастных группах детей и у подростков.

4.  Определить характер изменения уровней провоспалительных цитокинов: интерлейкина-1b, интерлейкина-6, фактора некроза опухоли-a в сыворотке крови больных кишечными инфекциями, вызванными патогенными и условно-патогенными энтеробактериями.

5.  Провести анализ мультифакторных связей между фенотипическими и генотипическими характеристиками культур и клинико-иммунологическими особенностями вызываемых ими кишечных инфекций у детей и подростков.

Основные положения, выносимые на защиту

1.  Условно-патогенные Enterobacteriaceae, вызывающие острые кишечные инфекции у детей и подростков, преимущественно относятся к родам Klebsiella spp., Citrobacter spp., Enterobacter spp., Morganella morganii, Hafnia alvei, Proteus spp. и наиболее актуальны в развитии кишечных инфекций у детей раннего возраста.

2.  Клинические штаммы условно-патогенных энтеробактерий, выделенные от детей и подростков при ОКИ, являются потенциально патогенными, поскольку отличаются наличием генетических маркеров – «островов» патогенности. Определение «островов» патогенности у клинических штаммов условно-патогенных энтеробактерий свидетельствует об их этиологической значимости.

3.  Острофазный ответ организма при внедрении УПЭ аналогичен таковому при инфекциях, вызываемых патогенными энтеробактериями.

Научная новизна исследования

Впервые показано, что клинические штаммы УПЭ, выделенные от детей и подростков с ОКИ, несут фрагменты ДНК «островов» патогенности, гомологичные известным генам кластеров патогенности Escherichia coli. У 32,6% бактерий обнаружено присутствие фрагментов генов, определяющих способность бактерий синтезировать фимбрии типа S (sfaG), a-гемолизин (hlyA и hlyB), цитотоксический некротизирующий фактор (cnf1) и термостабильный энтеротоксин b (estB). Обнаружены достоверные связи между частотой обнаружения генетических маркеров «островов» патогенности в парах: cnf1 – hlyВ и hlyА – sfaG. Показана связь между наличием у возбудителя фрагментов генов «островов» патогенности и клиническими проявлениями ОКИ.

Впервые определена динамика и связи между уровнями сывороточных провоспалительных цитокинов при ОКИ, вызванных условно-патогенными энтеробактериями у детей и подростков. Показано, что внедрение данных возбудителей в организм так же, как при шигеллезах и сальмонеллезах, индуцирует системную воспалительную реакцию, которая сопровождается увеличением уровня провоспалительных цитокинов интерлейкина-1β (ИЛ-1β), интерлейкина-6 (ИЛ-6) и фактора некроза опухоли-a (ФНО-a). Степень изменения концентраций цитокинов коррелирует с тяжестью заболевания.

Впервые при ОКИ, вызванных условно-патогенными энтеробактериями у детей и подростков, показаны связи между биологическими и молекулярно-генетическими характеристиками возбудителей, уровнями сывороточных провоспалительных цитокинов и клиническими проявлениями заболеваний.

Практическая значимость работы

Определены генетические маркеры (cnf1, hlyВ, hlyА, sfaG, estB), информативные при оценке этиологической значимости и расшифровке вспышек ОКИ, вызванных условно-патогенными энтеробактериями у детей и подростков. Изучена диагностическая ценность определения цитокинового профиля сыворотки крови (ИЛ-1β, ИЛ-6 и ФНО-a) в остром периоде и периоде реконвалесценции у детей и подростков с кишечными инфекциями. Определены клинико-иммунологические показатели, прогнозирующие течение ОКИ у детей и подростков.

Внедрение результатов работы в практику

Результаты исследований внедрены в работу МУ Инфекционная клиническая больница №4 г. Уфы, используются в учебном процессе на кафедрах инфекционных болезней с курсом дерматовенерологии ИПО, детских инфекционных болезней и лабораторной диагностики ИПО Башкирского государственного медицинского университета.

Апробация работы

Основные положения диссертации доложены на Республиканской конференции молодых ученых РБ «Медицинская наука-2004» (Уфа, 2004); Российской научно-практической конференции «Узловые вопросы борьбы с инфекцией» (Санкт-Петербург, 2004); XIII международной конференции «Ферменты микроорганизмов: структура, функции, применение» (Казань, 2005); Республиканской конференции молодых ученых РБ «Медицинская наука-2005» (Уфа, 2005); Всероссийской научно-практической конференции «Терапия инфекционных заболеваний у детей: нерешенные вопросы» (Санкт-Петербург, 2005); II международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2005); Российской научно-практической конференции «Инфекционные болезни: проблемы здравоохранения и военной медицины» (Санкт-Петер-бург, 2006), Национальных днях лабораторной медицины России (Москва, 2006).

Работа апробирована на совместном заседании кафедр инфекционных болезней с курсом дерматовенерологии ИПО, микробиологии с иммунологией и вирусологией, инфекционных болезней, детских инфекционных болезней, лабораторной диагностики ИПО Башкирского государственного медицинского университета 9 июня 2006г.

Личный вклад автора. Диссертация представляет собой анализ и обобщение результатов исследований, полученных автором лично. В работах выполненных в соавторстве, вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 работ, в том числе 3 - в центральных журналах.

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы исследования», трех глав собственных результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, приложений. Работа изложена на 145 страницах машинописного текста, содержит 14 таблиц, 23 рисунка. Список литературы включает 226 источников: 75 отечественных и 151 зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

В соответствии с целью диссертационной работы исследования выполнялись в три этапа. На первом этапе проводился клинический отбор больных из числа детей и подростков, госпитализированных в 2004 году в МУ ИКБ №4 г. Уфы с диагнозом «острая кишечная инфекция». Общее количество детей, находившихся на стационарном лечении составило 2421 человек, их них 310 перенесли ОКИ, вызванную УПЭ. Объектом непосредственного диссертационного исследования явились 157 человек, находившихся на стационарном лечении в период с февраля по август 2004 года. Для постановки диагноза использовались клинические, бактериоскопические, бактериологические, серологические, иммунологические методы исследования. Обследование больных проводили в соответствии с республиканскими медико-экономическими стандартами: общий анализ крови, общий анализ мочи, копроцитологическое и бактериологическое исследование испражнений. Клинический материал: испражнения, рвотные массы и промывные воды желудка исследовали на наличие патогенной и условно-патогенной флоры. Бактериологическими методами выявляли Salmonella spp., Shigella spp., Yersinia enterocolitica, Escherichia coli, Campylobacter jejuni, Staphylococcus spp., условно-патогенные Enterobacteriaceae, неферментирующие грамотрицательные палочки; для качественного выявления в испражнениях ротавирусного антигена использовали иммуноферментный метод. Бактериоскопический метод применяли для обнаружения цист лямблий и яиц гельминтов.

При обнаружении УПЭ всем больным проводилась РНГА (реакция непрямой гемагглютинации) с шигеллезными (Sh. flexneri, Sh. sonnei) и сальмонелезными диагностикумами. Выборочно сыворотки 43 детей с ОКИ, вызванными УПЭ, исследованы в реакции агглютинации (РА) на наличие антител к аутоштамму. Для этого из клинических штаммов УПЭ (концентрация 106 и выше) готовили взвесь живой 20-часовой культуры для обнаружения Н-агглютинации, а из кипяченой суточной агаровой культуры - для обнаружения О - агглютинации. Исследовались сыворотки, полученные в течение 72 часов и через 7-10 дней с момента заболевания.

На втором этапе осуществлялась этиологическая расшифровка патологии микробиологическими и молекулярно-генетическими методами. Для сбора коллекции клинических штаммов УПЭ исследовали клинический материал: испражнения, рвотные массы и промывные воды желудка. Выделение чистой культуры микроорганизмов осуществляли по общепринятой методике, с использованием отечественных питательных сред. Посевы инкубировали при 37°С в течение суток, и при необходимости – дополнительно при комнатной температуре. Подозрительные колонии дифференцировали макроскопически по морфологии и микроскопически – после окраски препаратов по методу Грама. Биохимическую идентификацию осуществляли при использовании сред Гисса, СИБ (системы индикаторные бумажные), ПБДЭ (пластины биохимические для дифференциации энтеробактерий) («Диагностические системы» г. Н.Новгород) и системы «Enterotest» («Chemapol», Чехия). Антибиотикочувствительность клинических штаммов оценивали дискодиффузионными методом с дисками, содержащими ампициллин, карбенициллин, гентамицин, тетрациклин, левомицетин, полимиксин, канамицин, цефалексин, нитрофурантоин.

Тотальную бактериальную ДНК выделяли из суточной агаровой культуры, используя стандартные наборы для выделения ДНК («Интерлабсервис», Россия). Для избирательной амплификации in vitro определенных участков ДНК был использован метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). ПЦР проводилась в амплификаторе МС-16 «Терцик» («ДНК-технология», Россия). Для выполнения работы использовали праймеры к ряду генов, обнаруженных в составе «островов» патогенности у E. coli, определяющих способность бактерий синтезировать фимбрии типа S (sfaG), a-гемолизин (hlyA и hlyB), цитотоксический некротизирующий фактор (cnf1) и термостабильный энтеротоксин b (estB). Праймеры синтезированы в НПФ «ДНК-технология» (Россия).

На третьем этапе изучалась активность некоторых провоспалительных цитокинов (ЦТ) в сыворотке крови больных ОКИ. Цитокиновый профиль количественно оценивали твердофазным иммуноферментным методом при исследовании сыворотки крови в динамике: первая - в период 72 часов от начала заболевания и вторая - через 7-10 дней. В контрольной группе, которую составили 15 здоровых детей, сыворотка исследовалась однократно. Для измерения уровня ЦТ использовали стандартные тест системы ProCon ( контур», Россия). При этом непосредственно определяли содержание в крови ИЛ-1β, ИЛ-6 и ФНО-a. Для сравнения изменений показателей ЦТ при ОКИ, вызванных УПЭ, исследовали уровень аналогичных ЦТ в сыворотке детей с бактериологически подтвержденными диагнозами шигеллеза и гастроинтестинальной формой сальмонеллеза.

Статистическую обработку данных проводили с использованием программы Statistica for Windows (v. 5.11).

Результаты исследования и их обсуждение

Среди госпитализированных в МУ ИКБ №4 г. Уфы детей с диагнозом «острая кишечная инфекция» за период 2гг. удельный вес пациентов с ОКИ, вызванными УПЭ, составил 12,8 - 21,2%. При этом чаще выделялись Klebsiella spp. (41,1–51,6%) и Proteus spp. (14,5–30,2%), несколько реже Citrobacter spp. (9,3–12,1%), Enterobacter spp. (6–11,9%), Morganella morganii (8,1–11,3%) и Hafnia alvei (2,1-3,9%).

В 2004 году в ИКБ №4 г. Уфы на стационарном лечении с диагнозом ОКИ, вызванные УПЭ, находилось 310 детей. В ходе обследования больных была собрана коллекция из 89 клинических штаммов УПЭ: Klebsiella spp. (37шт), Citrobacter spp. (9шт), Enterobacter spp. (17шт), Hafnia alvei (1шт), Morganella morganii (11шт), Proteus spp. (14шт). Все выделенные культуры обладали типичной биохимической активностью. Определение чувствительности культур к антибиотикам показало, что 80 штаммов (90%) были резистентны к 4-7 препаратам, в то время как 7 культур (7,8%) резистентны к 1-3 препаратам и лишь 2 штамма (2,2%) - Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae были чувствительны ко всем антибиотикам. Наибольшая резистентность наблюдалась к нитрафурантоину, левомицетину, тетрациклину и ампициллину, наименьшая – к гентамицину и цефалексину. Различия превалирующей антибиотикорезистентности у клинических штаммов различных родов были несущественны.

Методом ПЦР в,6%) случаях было установлено наличие у собранных клинических штаммов УПЭ фрагментов ДНК, специфичных известным генам кластеров патогенности E. coli. В общем пуле исследуемых культур образование искомых ампликонов при использовании праймеров к hlyA имели место в 9 (10,1%), hlyB –,2%), sfaG – 8 (9%), cnf1 – 9 (10,1%), estB – 3 (3,4%) случаях, соответственно. Встречаемость фрагментов генов «островов» патогенности по родам представлена в таблице 1. Различия по частоте обнаружения соответствующих фрагментов генов у различных родов исследованных штаммов были несущественны. Выявлены прямые средние значения коэффициентов парной корреляции между генетическими детерминантами hlyB и cnf1 (r=0,59; Р<0,01), hlyA и sfaG (r=0,42; Р<0,05). В 65,5% случаев фрагменты генов обнаружены у культур, выделенных у детей до 3-х лет, причем фрагменты гена estB присутствовали только у штаммов, выделенных у детей до 3-х лет. У культур этой же возрастной группы обнаружены 66,7% детерминант hlyA, 70,9% – hlyВ, 55,5% – cnf1, 75% - sfaG. В то время как у штаммов, выделенных у детей 4-7 лет выявлены фрагменты только hlyA, hlyВ и cnf1, а у детей 8-14 лет и подростков – лишь hlyA и sfaG. Чаще (79,5%) фрагменты генов обнаружены у штаммов, полученных при среднетяжелых и тяжелых формах ОКИ.

Таблица 1

Частота обнаружения фрагментов генов «островов» патогенности у клинических штаммов условно-патогенных энтеробактерий, выделенных при острых кишечных инфекциях у детей и подростков

УПЭ	n (%)	hlyA n (%)	hlyB n (%)	sfaG n (%)	cnf1 n (%)	estB n (%)
Klebsiella spp.	37 (41,6)	1 (11,1)	4 (40,0)	3 (37,5)	5 (55,6)	0
Citrobacter spp.	9 (10,1)	3 (33,3)	0	2 (25,0)	0	0
Enterobacter spp.	17 (19,1)	3 (33,3)	0	2 (25,0)	0	0
Hafnia alvei	1 (1,1)	1 (11,1)	0	0	0	0
Morganella morganii	11 (12,4)	0	3 (30,0)	1 (12,5)	2 (22,2)	2 (66,7)
Proteus spp.	14 (15,7)	1 (11,1)	3 (30,0)	0	2 (22,2)	1 (33,3)
Итого	89 (100)	9 (100)	10 (100)	8 (100)	9 (100)	3 (100)

Обнаружено, что штаммы, несущие фрагменты генов «островов» патогенности, в 98,9% обладали множественной антибиотикоустойчивостью. Анализ сопряженности присутствия фрагментов генов «островов» патогенности и антибиотикорезистентности энтеробактерий показал наличие слабой прямой связи между наличием генов sfaG и устойчивостью к тетрациклину(r=0,21) и левомицетину (r=0,35); estB - гентамицину (r=0,12) и карбенициллину (r=0,18); hlyA – ампициллину (r=0,13) и левомицетину (r=0,14); hlyB – ампициллину (r=0,18) и цефазолину (r=0,11), cnf1 - ампициллину (r=0,13). В доступной нам литературе мы не нашли данные о взаимосвязи резистентности к данным антибактериальным препаратам и наличием генов «островов» патогенности у представителей семейства Enterobacteriaceae. Но показана прямая корреляционная связь между адгезивной активностью и резистентностью к антибиотикам у Morganella morganii, выделенных при кишечных и урологических инфекциях [ и др., 1998], также показана прямая связь детерминированных R-плазмидой адгезинов с наличием β-лактамазы у мультирезистентных (амоксициллин, цефалотин, цефотаксим, канамицин, амикацин, хлорамфеникол, тетрациклин, налидиксовая кислота) Klebsiella pneumoniae, выделенных при нозокомиальных инфекциях [Livrelli V. et al., 1996].

Статистический анализ наличия фрагментов генов «островов» патогенности, полирезистентности культур и клинических проявлений заболеваний показал существование прямых корреляционных связей между фрагментами генов hlyB, sfaG, cnf1 и синдромом интоксикации, уровнем и продолжительностью лихорадки, присутствием патологических примесей в испражнениях (табл.2).

Таблица 2

Корреляционные связи между фрагментами генов «островов» патогенности и антибиотикорезистентностью штаммов и клиническими симптомами острых кишечных инфекций

Клинические симптомы	hlyB	sfaG	cnf1	полирезис-тентность
степень подъема температуры	0,27	0,16	0,24	0,12
продолжительность лихорадки	0,16	0,27	0,15	0,10
уровень СОЭ	–	0,14	–	0,15
интоксикация	0,16	0,13	0,16	0,30
продолжительность рвоты	0,12	–	0,19	–
частота стула	–	0,22	0,13	–
продолжительность диареи	0,25	0,04	0,22	–
Патологические примеси в испражнениях:
зелень	0,24	0,05	0,25	0,11
лейкоциты	0,10	–	0,36	–
слизь	0,29	–	0,14	–

Факторный анализ также показал сопряженность синдрома интоксикации и детерминант hlyВ (r=0,36), cnf1 (r=0,29) и sfaG (r=0,12). Одновременно наличие данных генов сочеталось с появлением в стуле патологических примесей (слизь, лейкоциты, зелень), что указывало на развитие инфекционно - воспалительного типа диареи. Наши данные сопоставимы с данными других исследователей, которые продемонстрировали в экспериментальной модели (перевязанная петля кишечника кролика) развитие диареи воспалительного типа при инфицировании штаммами E. coli, содержащими гены hly и cnf1 в сочетании и по отдельности. При этом во всех случаях наблюдалось накопление жидкости в тонком и толстом кишечнике со слизью и кровью, а гистологическое исследование выявляло мультифокальные участки эрозий, гиперемию, отек и гиперплазию бокаловидных клеток толстого кишечника, а также инфильтрацию полиморфноядерными лейкоцитами собственной пластинки тонкого кишечника [Elliott S. J. et al., 1998].

Среди детей, госпитализированных с диагнозом ОКИ, вызванная УПЭ, большую часть (63%) составили пациенты до 3-х лет (до года – 32% и 1-3 года – 31%), дети 4-7 лет – 14,4%, 8-14 лет – 12%, подростки – 10,6%. Заболевания чаще протекали в легкой (40%) и среднетяжелой (57,1%) форме, с поражением верхних отделов желудочно-кишечного тракта в виде гастроэнтерита (86,6%). Среди 157 пациентов с учетом особенностей клинической симптоматики были выделены три группы больных.

Первую группу составили дети раннего возраста -,2%) человек, заболевание которых характеризовалось постепенным началом - с поражения желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) в виде затяжного гастроэнтероколита. Стул был жидкий, малыми порциями, 6-8 раз в сутки и более, с патологическими примесями в виде комочков слизи, зелени, продолжительность диареи всегда была более 7-10 дней. Отмечалась нечастая, упорная рвота, умеренное вздутие живота. Повышение температуры наблюдалось позднее и в половине случаев до субфебрильных значений, в то же время у всех детей наблюдались симптомы интоксикации: они становились капризными, беспокойными или, наоборот, сонливыми, вялыми, всегда снижался аппетит, появлялось срыгивание.

Вторую группу составили дети всех возрастов - ,3%) человек, у которых отмечалось острое начало заболевания с одновременным развитием общеинфекционного синдрома (интоксикация и лихорадка) и поражения ЖКТ в виде гастроэнтерита или гастроэнтероколита: повторной, но кратковременной рвоты, диареи. Стул был жидкий, каловый, чаще (92,8%) без патологических примесей, у подавляющего большинства пациентов наблюдались частота стула до 5 раз в сутки (88,4%) и продолжительность диареи до 7 дней (98,2%). Симптомы интоксикации были умеренно выражены и проявлялись в виде вялости, слабости, недомогания, снижения аппетита, дети раннего возраста становились капризными, беспокойными. Температура, как правило (76%), не превышала 38,5°С и нормализовалась к 4-му дню заболевания (91,1%).

Третью группу составили дети старше 3-х лет и подростки -,5%) человек, у которых ОКИ протекали по типу пищевой токсикоинфекции (ПТИ) - острый гастроэнтерит с доминированием синдромов интоксикации и/или обезвоживания [, 2000]. При этом заболевание характеризовалось бурным началом - болями в животе, многократной рвотой (более 10 раз), выраженной интоксикацией, которая проявлялась резкой слабостью, недомоганием, головной болью, наблюдалось повышение температуры до субфебрильных цифр у 62,1% пациентов и фебрильных цифр – у 37,9% больных. Пациенты жаловались на сухость во рту, жажду. Острый период был кратковременным и у 51,7% составил одни сутки (абортивное течение). В картине ЖКТ расстройств доминировали симптомы диспепсии: тошнота, позывы на рвоту, урчание в животе, схваткообразные боли различной интенсивности. Диарея была умеренной: стул оценивался как водянистый в 31%, жидкий в 31% и кашицеобразный в 27,7% случаев, частотой от 1 до 5 раз в сутки, продолжительностью 1-3 дня. У 3 (10,3%) больных стул оставался оформленным. У всех пациентов из испражнений, а также рвотных масс и промывных вод желудка высевались УПЭ.

Выборочно сыворотки 43 детей различных возрастов исследовали на наличие антител в РА с аутоштаммом (Н- и О-агглютинации). При выявлении Klebsiella spp. исследовалась способность только к О-агглютинации. У 23 детей проводилось исследование с парными сыворотками, у 20 - исследовали сыворотку, взятую в периоде реконвалесценции. У всех больных первые порции сыворотки показали отрицательные результаты, из 43 вторых порций сывороток%) – положительную реакцию. При среднетяжелой форме ОКИ (67,4% обследованных) антитела к аутоштамму при О-агглютинации в среднем определялись в титрах 1:400, при Н-агглютинации – 1:80. При легкой форме заболевания (27,9%) в половине случаев антитела не определялись, а образовавшиеся антитела присутствовали в низких титрах: 1:100 и 1:20, соответственно. При тяжелой форме болезни (4,7%) также обнаруживался низкий титр антител: 1:100 и 1:20, соответственно. У 6 человек (14%) антитела не обнаружены, это были дети школьного возраста и подростки с легкими формами и абортивным течением ОКИ, что согласуется с данными других авторов [, 1991].

Анализ цитокинового профиля при инфекционных заболеваниях вносит понимание в механизмы функционально-морфологических изменений в органах и тканях и раскрывает их связь с клиническими проявлениями. Мы изучили динамику изменения концентраций провоспалительных цитокинов: ИЛ-1β, ИЛ-6 и ФНО-a в сыворотке крови детей и подростков с ОКИ, вызванными УПЭ и патогенными энтеробактериями (ПЭ). Под наблюдением находились 73 человека в возрасте от 3 до 17 лет. Из них 41 больной с ОКИ, вызванными УПЭ: 15 - Klebsiella spp., 5 - Proteus spp., 7 - Morganella morganii, 5 - Citrobacter spp. 8 - Enterobacter spp., 1 - Hafnia alvei. Остальные 32 пациента с ОКИ, вызванными ПЭ: 8 - Salmonella spp., 24 - Shigella spp. Все пациенты имели легкую и среднетяжелую формы заболеваний, гладкое течение. Шигеллез протекал в энтероколитическом варианте, где лишь у одного ребенка имел место гемоколит, сальмонеллез – в гастроэнтеритическом варианте. Кишечные инфекции, вызванные УПЭ, у детей дошкольного и школьного возраста проявлялись в виде гастроэнтерита (или гастроэнтероколита), у подростков протекали по типу ПТИ.

Развитие заболеваний сопровождалось существенным повышением уровней ЦТ (табл. 3, 4). Анализ динамики значений ЦТ между острым периодом и периодом реконвалесценции выявил достоверное снижение концентраций всех ЦТ в обеих сравниваемых группах. Примечательно, что только значения ИЛ-6 в периоде реконвалесценции снижались до нормы во всех группах и независимо от формы тяжести ОКИ. При шигеллезах и сальмонеллезах концентрации всех ЦТ в остром периоде заболеваний были достоверно выше (Р<0,001), чем при ОКИ, вызванных УПЭ. Известно, что УПЭ размножаются на поверхности эпителия слизистой кишечника без повреждения эпителиоцитов или с развитием умеренного воспаления, а инфекции, вызываемые Shigella spp. и Salmonella spp, характеризуются резко выраженным воспалением слизистой [, 1999; Полоцкий Ю. Е. и др., 1992], где большую роль играют ЦТ [Fleckenstein J. M., 2001; Kagnoff M. F., 1997]. При изучении шигеллеза, показано, что локальный цитокиновый ответ зависит от гистологической картины в кишечнике: в биоптатах прямой кишки с нейтрофильной инфильтрацией и микроязвами уровень ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-10, ИЛ-8 и ФНО-a был значительно выше, чем в биоптатах с катаральным воспалением. Здесь же обнаружено, что одновременное содержание ЦТ в плазме в 100 раз ниже, чем в фекалиях [Raqib R. et al., 1995].

Таблица 3

Концентрации сывороточных цитокинов при острых кишечных инфекциях, вызванных условно-патогенными энтеробактериями

Цитокины	M±m, пг/мл	Контрольная группа, пг/мл (n=15)	p<
Острый период	Выздоровление
Легкая форма (n=22)
ИЛ-1b	236,88 ± 120,01*	27,45 ± 12,56	24,18 ± 15,7	0,001
ФНО a	280,13 ± 141,06*	15,46 ± 5,46	13,96 ± 6,8	0,001
ИЛ-6	5,86 ± 4,32*	0,00	0,00	0,001
Среднетяжелая форма (n=19)
ИЛ-1b	838,04 ± 253,78*	29,29 ± 17,65	24,18 ± 15,7	0,001
ФНО a	811,87 ± 385,38*	120,11 ± 56,78*	13,96 ± 6,8	0,001
ИЛ-6	35,38 ± 17,24*	0,00	0,00	0,001

Примечание.* - Р<0,001 достоверность различий с группой здоровых лиц.

Таблица 4

Концентрации сывороточных цитокинов при острых кишечных инфекциях, вызванных патогенными энтеробактериями

Цитокины	M±m, пг/мл	Контрольная группа, пг/мл (n=15)	p<
Острый период	Выздоровление
Легкая форма (n=14)
ИЛ-1b	393,14 ± 151,84*	24,41 ± 9,14	24,18 ± 15,7	0,001
ФНО a	722,32 ± 342,51*	22,2 ± 8,32**	13,96 ± 6,8	0,001
ИЛ-6	27,64 ± 11,49*	0,00	0,00	0,001
Среднетяжелая форма (n=18)
ИЛ-1b	1287,72 ± 271,49*	54,39 ± 28,09*	24,18 ± 15,7	0,001
ФНО a	1784,21 ± 688,96*	164,68 ± 79,05*	13,96 ± 6,8	0,001
ИЛ-6	86,91 ± 36,92*	0,00	0,00	0,001

Примечания: * - Р<0,001 достоверность различий с группой здоровых лиц;

** - Р<0,05 достоверность различий с группой здоровых лиц.

В наших исследованиях достоверные различия в уровнях ЦТ при ОКИ, вызванных патогенными и УПЭ, могут, по-видимому, указывать на различную глубину поражения слизистой оболочки кишечника. Сравнение уровней ЦТ между легкой и среднетяжелой формами заболеваний показало, что концентрации ЦТ при среднетяжелой форме достоверно выше в обеих сравниваемых группах, что также может указывать на различную глубину поражения слизистой оболочки кишечника. Такие же данные получены при изучении у детей шигеллеза [De Silva D. G. et al., 1993] и брюшного тифа [Bhutta Z. A. et al., 1997; Butler T. et al., 1993].

Амплитуда значений изученных ЦТ представлена на рис. 1.

Рис. 1. Колебания значений ИЛ-1b, ФНО-a и ИЛ-6 у детей и подростков с острыми кишечными инфекциями, вызванными патогенными (ПЭ) и условно-патогенными (УПЭ) энтеробактериями

Концентрации ИЛ-1b и ФНО-a сопоставимы, а ИЛ-6 значительно ниже. Аналогичные результаты были получены при изучении способности человеческих мононуклеарных клеток периферической крови продуцировать данные ЦТ. Было установлено, что при воздействии различных стимулов: липополисахарид, фитогемагглютинин, Staphylococcus epidermidis секреция ИЛ-6 всегда в несколько раз ниже, чем секреция ИЛ-1b и ФНО-a, и высоко коррелирует с ними [Schindler R. et al., 1990]. Нами также выявлены прямые корреляционные связи: ИЛ-1b и ФНО-a (r=0,74), ИЛ-6 и ФНО-a (r=0,71) ИЛ-1b и ИЛ-6 (r=0,61). Прямые корреляционные связи указывают на однотипную направленность действия данных ЦТ и их взаимозависимость.

Статистический анализ корреляционных связей ЦТ и клинических проявлений ОКИ, выявил сильную прямая связь между ИЛ-1b, ФНО-a и степенью интоксикации (r=0,65 и r=0,59, соответственно), величиной и продолжительностью лихорадки (r=0,86 и r=0,66, соответственно), прямую связь средней силы с продолжительностью рвоты (r=0,48 и r=0,41, соответственно), длительностью синдрома диареи (r=0,37 и r=0,54, соответственно), воспалительными изменениями картины крови: количеством лейкоцитов (r=0,40 и r=0,52, соответственно) и СОЭ (r=0,65 и r=0,52, соответственно). Для ИЛ-6 выявлена прямая средняя связь с уровнем интоксикации (r=0,40), величиной и продолжительностью лихорадки(r=0,45), количеством лейкоцитов (r=0,44) и уровнем СОЭ (r=0,42). Выявленные высокие корреляционные связи ИЛ-1b и ФНО-a (ведущих медиаторов развития местной воспалительной реакции и острофазного ответа на уровне организма) с синдромом интоксикации, в том числе, близкая по значениям к сильной прямая корреляция с уровнем СОЭ, которое отражает наличие в крови острофазных белков, и лихорадки указывает на участие данных ЦТ в патогенезе названных синдромов [, 1999; , 1997; Henderson B. et al., 1996]. При изучении белков острой фазы воспаления при ОКИ у детей, показано, что в 87,5%, независимо от этиологии, отмечается изменения данных агентов, что свидетельствует об активации иммунной защиты, в том числе цитокинового звена [ и др., 2005].

Факторный анализ также показал взаимосвязь ИЛ-1b, ФНО-a и, в меньшей степени, ИЛ-6 с тяжестью течения ОКИ, которая, в свою очередь, определялась синдромом интоксикации (величиной и продолжительностью лихорадки, длительным сохранением рвоты, воспалительными изменениями картины крови) и длительностью диареи, причем, имелась взаимосвязь как острофазных концентраций ЦТ, так и уровней в периоде ранней реконвалесценции.

Известно, что локально синтезированный ИЛ-6 лишь в небольших количествах поступает в системный кровоток [Roth J. et al., 2001], высокие концентрации сывороточного ИЛ-6 обнаруживаются при генерализованных процессах - шоке и сепсисе [Barton B. E. et al., 1993]. Опираясь на многочисленные исследования функции ИЛ-6 в разных тканях и при различных заболеваниях, в настоящее время полагают, что именно ИЛ-6 является ключевым ЦТ в патогенезе многих заболеваний, включая ОКИ [Vaisman N. et al., 2003]. Так, изучение секреции сывороточных ЦТ при шигеллезе и брюшном тифе у детей показало, что уровень ИЛ-6 различался при осложненных (лейкемоидные реакции, тромбоцитопении, затяжной колит, гемолитико-уремический синдром) и гладких течениях инфекций (Р<0,001), в то время как значения ФНО-a были повышены, но достоверно не различались [Bhutta Z. A. et al., 1997; De Silva D. G. et al., 1993].

Учитывая меньшую связь ИЛ-6 с общеинфекционным синдромом и снижение концентрации ИЛ-6 в периоде ранней реконвалесценции до показателей нормы у всех больных, в отличие от ИЛ-1b и ФНО-a, а также гладкое течение ОКИ у пациентов, вошедших в исследование и данные литературы, можно предположить, что низкие показатели ИЛ-6 в периоде выздоровления свидетельствуют об отсутствии осложнений и гладком течении ОКИ, и наоборот, сохраняющиеся высокие значения ИЛ-6 в периоде ранней реконвалесценции могут указывать на затяжное течение инфекции и/или наличие осложнений.

Анализ мультифакторных связей между фенотипическими и генотипическими характеристиками культур и клинико-иммунологическими особенностями вызываемых ими ОКИ у детей и подростков показал, что тяжесть заболевания определяется вкладом микро - и макроорганизма: наличие у возбудителя фрагментов генов hlyВ, sfaG и cnf1, а также множественной устойчивости к антибиотикам сопряжено с возрастанием тяжести проявлений ОКИ, а именно, усилением синдрома интоксикации, увеличением продолжительности лихорадки, пропорциональным возрастанием концентраций сывороточных цитокинов ИЛ-1β, ФНО-a и ИЛ-6 и увеличением длительности диареи инфекционно-воспалительного типа. В большей степени данные взаимосвязи отражаются на течении кишечных инфекций у детей раннего возраста.

Выводы

1. Условно-патогенные Enterobacteriaceae, выделенные при острых кишечных инфекциях у детей и подростков, относились к родам Klebsiella spp., Citrobacter spp., Enterobacter spp., Morganella morganii, Proteus spp., Hafnia alvei. Выделенные культуры обладали типичной биохимической активностью, 90% отличались полирезистентностью - устойчивостью к 4-7 препаратам, одновременно, штаммы, несущие фрагменты генов «островов» патогенности, в 98,9% обладали множественной антибиотикоустойчивостью.

2. В 32,6% случаев у тестируемых бактерий выявлены фрагменты ДНК, специфичные для известных генов кластеров патогенности. Искомые ампликоны при использовании праймеров к hlyA обнаружены в 10,1% случаев, hlyB – в 11,2%, sfaG – в 9%, cnf1 – в 10,1%, estB – в 3,4%. Отмечены парные корреляции между генетическими детерминантами hlyB и cnf1 (r=0,59; Р<0,01), hlyA и sfaG (r=0,42; Р<0,05), но не estB и другими генами. Обнаружены прямые корреляционные связи между наличием фрагментов генов, детерминирующих адгезины типа S (sfaG), и устойчивостью к тетрациклину (r=0,21) и левомицетину (r=0,35), estB – карбенициллину (r=0,18), hlyB – ампициллину (r=0,18).

3. Острые кишечные инфекции, вызванные условно-патогенными Enterobacteriaceae, составили 12,8-21,2% среди детей и подростков, госпитализированных в стационар с диагнозом «острая кишечная инфекция», чаще болели дети до трех лет (63%). Преобладали легкие (40%) и среднетяжелые (57,1%) формы. Клинические проявления зависели от возраста заболевших и протекали у детей до трех лет в виде затяжного гастроэнтероколита (18%) и острого гастроэнтерита (82%), у детей дошкольного и школьного возраста по типу пищевых токсикоинфекций (31,4%) и острого гастроэнтерита (или гастроэнтероколита) (68,5%) и у подростков – чаще по типу ПТИ (76,5%).

4. Внедрение условно-патогенных энтеробактерий в организм индуцирует системную воспалительную реакцию, сопровождающуюся увеличением концентраций сывороточных цитокинов ИЛ-1β, ИЛ-6 и ФНО-a пропорционально форме тяжести, при этом изменение уровней ИЛ-1β и ФНО-a сопряжено со степенью интоксикации и лихорадкой, низкие значения ИЛ-6 сопровождают неосложненные формы. Возрастание уровней ИЛ-1b и ФНО-a сопоставимы, ИЛ-6 – значительно ниже. Выявлены прямые корреляционные связи всех цитокинов между собой.

5. Наличие у возбудителя фрагментов генов hlyВ, sfaG, cnf1, а также множественной устойчивости к антибиотикам сопряжено с возрастанием тяжести кишечных инфекций: усилением синдрома интоксикации, проявляющегося высокими значениями и длительным сохранением лихорадки, упорной рвотой, воспалительными изменениями картины крови и пропорциональным возрастанием уровней сывороточных цитокинов ИЛ-1β, ФНО-a, ИЛ-6, а также увеличением длительности диареи инфекционно-воспалительного типа (наличие в стуле слизи, зелени и лейкоцитов).

Практические рекомендации

1. Для расшифровки внутрибольничных кишечных инфекций и групповых вспышек острых кишечных инфекций, вызванных условно-патогенными энтеробактериями у детей и подростков, рекомендуется определение генетических маркеров cnf1, hlyВ, hlyА, sfaG, estB.

2. Для оценки тяжести острых кишечных инфекций у детей дошкольного, школьного возраста и подростков и прогнозирования течения заболевания рекомендуется определения сывороточных цитокинов ИЛ-1β, ИЛ-6 и ФНО-a в остром периоде и периоде реконвалесценции. Значения цитокинов в течение 0-72 часа от начала заболевания, соответствующие легкой форме: ИЛ-1β = 120-360 пг/мл; ФНО-a = 140-420 пг/мл; ИЛ-6 = 2-10 пг/мл. Значения цитокинов в течение 0-72 часа от начала заболевания, соответствующие среднетяжелой форме: ИЛ-1β = пг/мл; ФНО-a = пг/мл; ИЛ-6 = 20-55 пг/мл. Значения цитокинов на 10-12 день болезни соответствующие неосложненному течению: ИЛ-1β менее 50 пг/мл; ФНО-a менее 170 пг/мл; ИЛ-6 менее 2 пг/мл.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. , , Сюндюкова энтеробактерий, выделенных при острых кишечных инфекциях у детей в МУ г. Уфы ИКБ №4 // Медицинская наука-2004: мат. Респ. конф. молодых ученых РБ / Гос. образоват. учреждение Башк. гос. мед. ун-т. - Уфа, 2004. - С.62-63.

2. , , Батыргареева острых кишечных инфекций, вызванных условно-патогенными энтеробактериями, по данным МУ г. Уфы ИКБ №4 // Медицинская наука-2004: мат. Респ. конф. молодых ученых РБ / Гос. образоват. учреждение Башк. гос. мед. ун-т. - Уфа, 2004. - С.63-64.

3. , , Петрова условно-патогенных энтеробактерий, выделенных в г. Уфе // Узловые вопросы борьбы с инфекцией: мат. Рос. науч.-практ. конф., 1-2 декабря 2004. - Санкт-Петербург, 2004. - С.93-94.

4. , , Петрова особенности острых кишечных инфекций, вызванных условно-патогенными энтеробактериями, у детей и подростков // Узловые вопросы борьбы с инфекцией: мат. Рос. науч.-практ. конф., 1-2 декабря 2004. - Санкт-Петербург, 2004. - С.94.

5. , , Мавзютов генетических маркеров, ассоциируемых с продукцией ферментов агрессии, среди клинических штаммов Enterobacteriaceae, выделенных при кишечных инфекциях у детей // Ферменты микроорганизмов: структура, функции, применение: сб. докл. XIII межд. конф, 4-8 апреля 2005. - Казань, 2005. - С.72-74.

6. , , Мавзютов -патогенные энтеробактерии в этиологии острых кишечных инфекций у детей и подростков // Молекулярная медицина и биобезопасность: мат. II межд. конф., 21 октября 2005. - Москва, 2005. - С.131.

7. , , «Острова» патогенности и антибиотикоустойчивость условно-патогенных энтеробактерий, выделенных при кишечных инфекциях // Терапия инфекционных заболеваний у детей: нерешенные вопросы: мат. Всерос. науч.-практ. конф, 11-13 октября 2005. - Санкт-Петербург, 2005. - С.50.

8. , , Валишин ответ при острых кишечных инфекциях, вызванных условно-патогенными энтеробактериями, у детей и подростков // Медицинская наука-2005: мат. Респ. конф. молодых ученых РБ / Гос. образоват. учреждение Башк. гос. мед. ун-т. - Уфа, 2005. - С.59-60.

9. , , Валишин вирулентности условно-патогенных штаммов Enterobacteriaceae, выделенных при кишечных инфекциях у детей через обнаружение «островов» патогенности // Медицинская наука-2005: мат. Респ. конф. молодых ученых РБ / Гос. образоват. учреждение Башк. гос. мед. ун-т. - Уфа, 2005. - С.60-61.

10. , , Мавзютов при острых кишечных инфекциях у детей // Инфекционные болезни: проблемы здравоохранения и военной медицины: мат. Рос. науч.-практ. конф., 22-24 марта 2006. - Санкт-Петербург, 2006. - С.116-117.

11. , , Мавзютов - иммунологические параллели при кишечных инфекциях у детей, обусловленных условно-патогенными и патогенными энтеробактериями // Клиническая лабораторная диагностика№9. - С.49.

12. , , Мавзютов генетической оценки потенциальной патогенности условно-патогенных энтеробактерий, выделенных при острых кишечных инфекциях // Клиническая лабораторная диагностика№9. - С.50-51.

13. , , Валишин к аутоштаммам условно-патогенных энтеробактерий в диагностике кишечных инфекций у детей // Клиническая лабораторная диагностика№9. - С.51.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ЖКТ – желудочно-кишечный тракт

ИЛ-1β – интерлейкин - 1β

ИЛ-6 – интерлейкин - 6

МУ ИКБ №4 г. Уфы – Муниципальное учреждение инфекционная

клиническая больница №4 г. Уфы

ОКИ – острые кишечные инфекции

ПТИ – пищевая токсикоинфекция

ПЦР – полимеразная цепная реакция

ПЭ – патогенные энтеробактерии

РА – реакция агглютинации

СОЭ – скорость оседания эритроцитов

УПМ – условно-патогенные микроорганизмы

УПЭ – условно-патогенные энтеробактерии

ФНО-a – фактор некроза опухоли - a

ЦТ – цитокины

cnf1 – цитотоксический некротизирующий фактор 1

estB – термостабильный энтеротоксин b

hlyА – a-гемолизин

hlyВ - a-гемолизин

sfaG – фимбрии типа S