На правах рукописи
БАЙДАК ДМИТРИЙ ВЛАДИСЛАВОВИЧ
«Влияние полиморфизма гена, кодирующего витамин – К эпоксид редуктазу (VKORС1) на эффективность и безопасность непрямых антикоагулянтов варфарина и аценокумарола».
14.00.25.- фармакология, клиническая фармакология.
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
МОСКВА
2007
Работа выполнена в филиале «клиническая фармакология»
ГУ НЦ Биомедицинских технологий Российской академии медицинских наук.
Научный руководитель:
-доктор медицинских наук
Владислав Николаевич Каркищенко
Официальные оппоненты:
- доктор медицинских наук, профессор
Евгения Валерьевна Ших
- доктор медицинских наук, профессор
Владимир Аркадьевич Орлов
Ведущая организация:
Московский государственный медико-стоматологический университет
Защита состоится 18.06.2007 г. в ___ часов на заседании Диссертационного совета Д 208.040.13 при Московской медицинской академии имени ( Москва, ул. М. Трубецкая, д. 8, стр. 2).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московской медицинской академии имени (Москва, 117998 Нахимовский проспект, 49).
Автореферат разослан ____________ 2007 г.
Ученный секретарь Диссертационного совета
к. м.н. _______________
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. В настоящее время непрямые антикоагулянты (варфарин, аценокумарол) зарекомендовали себя как высокоэффективные лекарственные средства (ЛС) для профилактики тромбоэмболических осложнений у больных с постоянной формой фибрилляции предсердий, у пациентов, перенесших операцию протезирования клапанов сердца, а также как средства вторичной профилактики сердечно-сосудистых эпизодов у больных, перенесших острый коронарный синдром [Hart R. G., 1999]. Наиболее часто непрямые антикоагулянты применяются у больных с постоянной формой фибрилляции предсердий, что регламентировано в международных рекомендациях [ACC/AHA/ESC guidelines for the management of patients with atrial fibrillation, 2001]. В связи с этим наметилась тенденция к более широкому применению этой группы ЛС в клинической практике.
Однако при применении непрямых антикоагулянтов врачи сталкиваются с проблемой развития нежелательных реакций в виде кровотечений, наиболее опасными из которых являются желудочно-кишечные кровотечения и кровоизлияния в мозг. Несмотря на внедрение метода подбора режима дозирования непрямых антикоагулянтов под контролем международного нормализованного отношения (МНО), частота кровотечений при применении препаратов из данной группы остается высоким и составляет, по данным разных авторов, от 10 до 25% [Copland М., 2001]. Выявлено множество предрасполагающих факторов к развитию кровотечений, в том числе и генетическая предрасположенность – полиморфизм гена CYP2C9, кодирующего основной фермент биотрансформации непрямых антикоагулянтов (CYP2C9) [ , 2006, Scordo MG, 2002, Morin S., 2004, , 2004, Herman D, 2005]. Однако, полиморфизм гена CYP2C9 не является единственной основой повышенной чувствительности к непрямым антикоагулянтам. В последнее время активно изучается полиморфизм гена VKORС1, кодирующий 1 субъединицу витамин – К эпоксид редуктазы, которая является «мишенью» для непрямых антикоагулянтов [D'Andrea, 2005]. Есть данные, что носители определенных генотипов по некоторым полиморфным маркерам гена VKORС1 «выходят» на более низкие дозы варфарина [Rieder M. J., 2005, Bodin L, 2005, Kohnke H., 2005, Yuan H Y, 2006, Aquilante CL, 2006]. Однако, влияние полиморфизма гена VKORС1 на развитие чрезмерной гипокоагуляции и развитием кровотечений при применении непрямых антикоагулянтов остается не изученным.
Цель исследования: оценить влияние носительства генотипов по полиморфному маркеру С1173Т гена VKORС1 на фармакдинамику непрямых антикоагулянтов варфарина и аценокумарола у больных с постоянной формой фибрилляции предсердий.
Задачи исследования:
1. Определить частоты аллелей и генотипов по полиморфному маркеру С1173Т гена VKORС1 у больных с постоянной формой фибрилляции предсердий в сравнении со здоровыми лицами.
2. Оценить влияние носительства генотипов по полиморфному маркеру С1173Т гена VKORС1 на режим дозирования непрямых антикоагулянтов варфарина и аценокумарола.
3. Оценить влияние носительства генотипов по полиморфному маркеру С1173Т гена VKORС1 на выраженность гипокоагуляции при применении непрямых антикоагулянтов варфарина и аценокумарола.
4. Оценить влияние носительства генотипов по полиморфному маркеру С1173Т гена VKORС1 на развитие кровотечений при применении непрямых антикоагулянтов варфарина и аценокумарола.
Научная новизна:
Впервые установлено отсутствие ассоциации между носительством генотипов по полиморфному маркеру С1173Т гена VKORС1 и развитием постоянной формой фибрилляции предсердий.
Впервые показано, что носительство генотипа ТТ носительства генотипов по полиморфному маркеру С1173Т гена VKORС1 ассоциируется с более высоким риском развития чрезмерной гипокоагуляции и кровотечений как при применении варфарина, так и аценокумарола. Впервые продемонстрировано, что у носителей генотипа ТТ носительства генотипов по полиморфному маркеру С1173Т гена VKORС1 индекс чувствительности к варфарину (МНО/Сss) ниже по сравнению с носителями генотипов СТ и ТТ, что свидетельствует о большей чувствительности лиц с ТТ генотипом к варфарину.
Практическая значимость.
Показана необходимость определения носительства генотипов по полиморфному маркеру С1173Т гена VKORС1, наряду с носительством аллельных вариантов CYP2C9*2 и CYP2C9*3 всем больным, которым планируется назначение непрямых антикоагулянтов варфарина и аценокумарола, и, в частности с постоянной формой фибрилляции предсердий.
Разработан алгоритм выбора начальной дозы варфарина и аценокумарола в зависимости от носительства генотипов по полиморфному маркеру С1173Т гена VKORС1 у лиц, не несущих аллельные варианты CYP2C9*2 и CYP2C9*3.
У больных, применяющих варфарин, результаты фармакогенетических исследований, следует дополнять определением индекса чувствительности к варфарину, равный отношению МНО к его минимальной равновесной концентрации.
Внедрение в практику. Отбор пациентов для проведения определения носительства генотипов по полиморфному маркеру С1173Т гена VKORС1, алгоритмы выбора начальной дозы варфарина и аценокумарола в зависимости от носительства генотипов по полиморфному маркеру С1173Т гена VKORС1 внедрены в работу Филиала «Клиническая фармакология» ГУ НЦ БМТ РАМН, Поликлиники Института клинической фармакологии ФГУ «НЦ ЭСМП» Росздравнадзора, ГКБ №36 г. Москвы, ГКБ №23
Результаты исследования используются в учебном процессе кафедры клинической фармакологии и пропедевтики внутренних болезней Московской медицинской академии им. , кафедры фармакологии и клинической фармакологии Ростовского государственного медицинского университета.
Положения, выносимые на защиту.
1. Отсутствует ассоциация между носительством генотипов по полиморфному маркеру С1173Т гена VKORC1 и развитием ИБС и постоянной формы фибрилляции предсердий.
2. Подобранная доза варфарина и аценокумарола, развитие эпизодов чрезмерной гипокагуляции и кровотечений при применении данных препаратов зависит от носительства генотипа по полиморфному маркеру С1173Т гена VKORС1.
Апробация работы. Основные результаты доложены и обсуждены на совместной научно практической конференции филиала «Клиническая фармакология» ГУ НЦ БМТ РАМН и кафедры клинической фармакологии и пропедевтики внутренних болезней ММА им. (октябрь 2006 г.), XIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (апрель 2006 г.), Научно-практической конференции «Клинико-фармакологические подходы к оптимизации фармакотерапии» (Москва, март 2006 г.), I Съезде клинических фармакологов Сибирского округа (Барнаул, май 2006 г.), Научно-практической конференции «Проблемы клинической фармакологии и моделирования в фармакологии и биомедицине» (Ростов-на-Дону, сентябрь 2006).
Связь задач исследований с проблемным планом. Диссертационная работа выполнена в соответствии с научным направлением филиала «Клиническая фармакология» ГУ НЦ БМТ РАМН по открытому плану «Оптимизация фармакотерапии заболеваний внутренних органов посредствам разработки рациональных методов контроля клинически значимых параметров фармакокинетики лекарственных средств» (номер гос. регистрации 01.206.110468) на базе ГКБ№23 им. «Медсантруд» г. Москвы.
Публикации по работе. По результатам выполнения исследований опубликовано 5 печатных работ.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов собственных исследований и их обсуждений, заключения, выводов и практических рекомендаций.
Работа изложена на 100 страницах машинописного текста, содержит 19 таблиц, 31рисунков. Список литературы включает 113 источников, из них 19 отечественной и 94 зарубежной литературы.
Конкретное личное участие автора в получении результатов.
Больным входящим в исследования проводился забор крови с целью коагулогического исследования, т. ж. для последующего определения полиморфных маркеров гена VKORC1 методом ПЦР-ПДРФ. Проводились клинические исследования (анализ крови, ЭХОКГ, мониторинг гемодинамики).Участие в обработки статистических данных ( Statistica 5.0 ).
Материалы и методы исследования
1. Характеристика участников и ход исследований
Характеристика больных. В исследование вошли 172 пациентов с ИБС и постоянной формой фибрилляции предсердий, артериальной гипертензией (АГ) 1 и 2 степени, хронической сердечной недостаточностью I и II функционального класса (ФК). Отбор пациентов проводился: ГКБ №23 им. Медсантуд в 3,10,11 терапевтических и в ревматологическом отд., ГКБ №36 отделениях кардиореанимации и неотложной кардиологии, с ноября 2005г. по январь 2007г..
Для исключения влияния генетического полиморфизма CYP2C9, в исследование по изучению влияния носительства генотипов по полиморфному маркеру С1173Т гена VKORС1 на режим дозирования непрямых антикоагулянтов варфарина и аценокумарола, из 172 больных с ИБС и постоянной формой фибрилляции предсердий, было отобрано 114 пациентов, не несущих «медленные» аллельные варианты CYP2C9*2 и CYP2C9*3. 114 отобранных пациента были рандомизированы в 2 группы:
· Группа, которым назначался варфарин (группа варфарина)- 57 человек;
· Группа, которым назначался аценокумарол (группа аценокумарола)- 57 человек.
Группы были сопоставимы по демографическим, клиническим характеристикам и сопутствующей терапии (таблица 1.1).
Доза варфарина подбиралась по стандартной схеме начиная с 5 мг/сутки, корректировалась в соответствии со значениями МНО. Начальная доза варфарина 5 мг/сутки назначалась в соответствии с Федеральным руководством по использованию лекарственных средств (Выпуск VII, 2006). Дозу варфарина расценивали как подобранную если она обеспечивала стабильный терапевтический уровень гипокоагуляции (МНО 2-3). Доза аценокумарола подбиралась по стандартной схеме начиная с 2 мг/сутки, корректировалась в соответствии со значениями МНО. Начальная доза ацнокумарола 2 мг/сутки назначалась в соответствии с Федеральным руководством по использованию лекарственных средств (Выпуск VII, 2006). Дозу аценокумарола расценивали как подобранную если она обеспечивала стабильный терапевтический уровень гипокоагуляции (МНО 2-3).
Всем пациентам определяли носительство генотипов по полиморфному маркеру С1173Т гена VKORС1, при этом в качестве биологического материала использовалась цельная кровь из кубитальной вены.
Диагноз ИБС устанавливался на основании клинических и анамнестических данных (перенесенный инфаркт миокарда, госпитализации по поводу других острых коронарных синдромов, стенокардия). Диагноз артериальной гипертензии устанавливался на основании рекомендаций по диагностике и лечению артериальной гипертензии Европейского общества кардиологов. Диагноз ХСН устанавливался на основании рекомендаций Европейского общества кардиологов, включавший в себя тщательный анализ жалоб больного, результаты физикального осмотра и данных инструментальных методик. ФК ХСН оценивался согласно рекомендациям Нью-Йоркской ассоциации по изучению сердца (NYHA) по результатам шестиминутного теста проводили путем измерения пройденного расстояния, которое способен пройти пациент в течение 6 мин. При этом до и после нагрузки регистрировали ЧСС, АД, ЧДД. Пациентов преодолевших от 426 до 550 м относили к I ФК ХСН; преодолевших от 300 до 425 м – ко II ФК ХСН; преодолевших от 150 до 300 м – к III ФК ХСН; преодолевших менее 150 м – к IV ФК ХСН. В исследование не включали пациентов со следующими заболеваниями: пороки сердца (кроме относительной митральной и/или трикуспидальной недостаточности, но не более 2-й степени), ХСН III и IV ФК, АГ 3 степени, острые нарушения мозгового кровообращения в анамнезе, тяжелые сопутствующие заболевания, сахарный диабет 1 и 2 типов.
Таблица 1.1
Демографическая, антропометрическая и клиническая характеристика больных, включенных в исследование
Показатель | Группа варфарина | Группа аценокумарола | р |
Число включенных больных · мужчины · женщины | 57 | 57 | - |
Рост, м | 1,73±0,12 | 1,75±0,09 | НД |
Вес, м | 83,1±9,6 | 81,4±7,5 | НД |
Возраст | 63,2±8,9 | 61,8±7,8 | НД |
Мерцательная аритмия постоянная форма | 57 | 57 | |
Артериальная гипертензия · 1 степень · 2 степень | 57 41 16 | 57 38 19 | |
ИБС · стенокардия напряжения · острый инфаркт миокарда в анамнезе | 57 51 12 | 57 49 15 | |
Хроническая сердечная недостаточность · I функционального класса по NYHA · II функционального класса по NYHA | 57 47 10 | 57 45 12 |
Характеристика здоровых лиц, включенных в исследование. В исследование включили здоровых лиц из этнической группы русских Московского региона лиц в возрасте 18 до 40 лет. В исследование не включались лица с органическими заболеваниями, для исключения которых все предполагаемые участники исследования были осмотрены терапевтом, а также прошли рутинное клиническое обследование: общий анализ крови, биохимический анализ крови, клинический анализ мочи, электрокардиографическое исследование (ЭКГ), эхокардиографическое исследование (ЭХО-КГ), ультразвуковое исследование (УЗИ) органов брюшной полости и почек. У всех лиц, включенных в исследование, проводили антропометрическое исследование. Всего в исследование распространенности аллельных вариантов генов CYP2C9, CYP2D6 и MDR1 в группе здоровых русских Московского региона было включено 100 человек. Демографическая и антропометрическая характеристика лиц, включенных в исследование здоровых лиц представлена в таблице 2.
Таблица 1.2
Демографическая и антропометрическая характеристика здоровых лиц, включенных в исследование
Показатель | Здоровые русские Московского региона n=100 |
Пол М / Ж | 48 / 52 |
Возраст, годы | 33,2±5,3 |
Рост, м | 1,67±0,09 |
Вес, кг | 71,0±16,3 |
2. Методы, использованные в исследовании
Определение аллельных вариантов CYP2C9*2 и CYP2C9*3. В данной работе изучали частоты двух наиболее значимых полиморфных маркеров гена CYP2C9, характерных для европейцев: нуклеотидной замены в третьем экзоне цитозинового нуклеотида на тимидиновый в положении 416 (С416Т), соответствующий аминокислотному полиморфизму (аргинин или цистеин) в положении 144 (Arg144Cys), и нуклеотидной замены в седьмом экзоне цитозинового нуклеотида на адениновый в положении 1061 (С1061А), соответствующий аминокислотному полиморфизму (изолейцин или лейцин) в положении 359 (Ile359Leu). Из четырех возможных комбинаций аллельных вариантов гена CYP2C9 у европейцев обнаружены три. Они получили обозначения CYP2C9*1 (Arg144-Ile359) – так называемый «дикий тип», CYP2C9*2 (Cys144-Ile359) и CYP2C9*3 (Arg144-Leu359). Аллельные варианты гена выявляли методом ПЦР-ПДРФ (полимеразной цепной реакции с последующим изучением полиморфизма длин рестрикционных (лат. фрагментов). Каждую нуклеотидную замену изучали по отдельности. Праймеры изготовлены , Москва. Фрагменты ДНК, образующиеся после рестрикции, наносили на электрофорез в полиакриламидном геле. Для оптимальной работы рестриктаз реакцию проводили в буфере, рекомендованном производителем. При амплификации фрагмента, содержащего полиморфный маркер Arg144Cys, образуется продукт длиной 129 п. н. Его подвергали рестрикции рестриктазой PceI («СибЭнзим», Новосибирск). После рестрикции образуются фрагменты 109 и 20 п. н. для «Cys» - варианта. «Arg» - вариант остается нерасщепленным. При амплификации фрагмента, содержащего полиморфный маркер Ile359Leu образуется фрагмент длиной 102 п. н. Данный фрагмент обрабатывался рестриктазой Bse3DI («СибЭнзим», Новосибирск). В результате рестрикции образуются фрагменты 80 и 20 п. н. для «Ile» - варианта. «Leu» - вариант остается нерасщепленным. Taq-ДНК-полимераза, а также рестриктазы Bse3DI и PceI закуплены у НПО «СибЭнзим» (Новосибирск). Синтез олигонуклеотидов выполнен (Москва). Натрия додецилсульфат, бромистый этидий – фирмы “Serva” (Германия). Дезоксинуклеотидтрифосфаты – производства НПО «СибЭнзим» (Новосибирск). Протеиназа К, Тритон Х-100®, Твин-20 – производство фирмы “Sigma” (США). Трис, минеральное масло, ЭДТА, акриламид, N, N-метилен-бисакриламид, натрий бикарбонат, натрий хлористый, борная кислота, бромфеноловый синий, ксиленцианол – закуплены на фирме «Диаэм» (Москва). TEMED и аммоний надсернокислый – производства фирмы «Reanal» (Венгрия). Уксусная кислота, азотная кислота, едкий натр, соляная кислота, фенол, хлороформ, этанол, изопропиловый спирт - производства «Реахим» (Москва). ПЦР проводили на амплификаторе МС2 («ДНК - Технология», Москва) в 25 мкл реакционной смеси, содержащей буфер для ПЦР, 0.2 мМ каждого dNTP, по 10 пикомолей каждого из праймеров, геномную ДНК и 1 ед. активности Taq-ДНК-полимеразы. Буфер для ПЦР включал 60 мM Трис-HCl (pH 8.5 при 250С), 25 мМ KCl, 0,1% Tween 20 и хлористый магний. Концентрацию хлористого магния подбирали опытным путем, выбирая вариант, оптимальный по соотношению количество продукта – специфичность продукта. На начальной стадии ПЦР денатурировали ДНК при 940С в течение 2 мин. Затем осуществляли 35 циклов трехступенчатой программы, включающей денатурацию ДНК (940С/10 сек), отжиг (посадку) праймеров (650С/20 сек) и синтез второй цепи (элонгацию) (720С/10 сек). Условия ПЦР и последовательности праймеров для амплификации исследованных локусов приведены в табл. 2.1.
Последовательности праймеров и особенности амплификации
Полиморфный маркер | Прямой и обратный праймеры (5’→ 3’) | MgCl2, мМ |
Arg144Cys | CYS2C9-F-144 5`-GGGGAAGAGGAGCATTGAGGCC-3` CYS2C9-R-144 5`-CAGTAGAGAAGATAGTAGTCCAGT-3` | 2.0 |
Ile359Leu | CYS2C9-F-359 5`-CAGAAACCGGAGCCCCTGCAT-3` CYS2C9-R-359 5`-AGGCTGGTGGGGAGAAGGGCAA-3` | 1.0 |
Тот или иной аллельный вариант выявляли путем обработки рестриктазами продуктов ПЦР, содержащих полиморфный участок. В случае полиморфного маркера Arg144Cys использовали рестриктазу PceI, а в случае Ile359Leu – Bse3DI. К 10 мкл амплификационной смеси добавляли 1,5 мкл 10-кратного буфера, содержащего ацетилированный бычий сывороточный альбумин (БСА) (1 мг/мл) и 2 ед. фермента. Реакции проводили в течение ночи при температурах, заявленных производителем, как оптимальные: 500С для PceI и 600С для Bse3DI. Фрагменты ДНК после рестрикции разделяли в полиакриламидном геле (ПААГ). Электрофорез осуществляли в вертикальной камере с использованием в качестве электродного буфера 1хТВЕ при напряженности поля ориентировочно 15 В/см. Использовали 10%-ные гели длиной 12 см и толщиной 0.8 мм при соотношении акриламид / N, N-метиленбисакриламид 29:1. В лунки геля наносили по 9 мкл смеси, содержащей 7,5 мкл анализируемой ДНК и 1,5 мкл раствора лидирующего красителя. Для определения длины рестрикционных фрагментов на наносили в качестве контроля набор фрагментов известной длины – ДНК плазмиды pUC19, обработанной рестриктазой MspI, в количестве 300 нг на дорожку геля. ПААГ выдерживали в растворе бромистого этидия (10 мкг/мл) в течение 5-15 мин, промывали водой, затем просматривали в ультрафиолетовом свете, записывая в журнал результаты.
Аналогичным образом определяли носительство генотипов по полиморфному маркеру гена С1173Т гена VKORC1 (по номенклатуре NCBI он числится как С6484Т). При этом последовательность праймеров была следующей:
· VC6484F 3'-TCTGATGCAAAACCGAGTGAACC-5'
· VC6484R 3'-GTGCCTTGGACCCTGCCCGAGAAA-5'
Температура отжига реакции - 60˚С. Концентрация хлорида магния в реакционной смеси – 2мМ. В результате ПЦР образуется фрагмент длиной 592 п. н. Рестриктаза, опознающая замену: Eco130I (Fermentas, Литва); сайт узнавания – 5’-C’CWWGG-3’. Температура рестрикции - 37˚С. При разрезании продукта ПЦР содержащего аллель С, образуются фрагменты 506, 78 и 8 п. н., а в случае аллеля Т – 584 и 8 п. н., соответственно. Геномная ДНК, использованная в реакции, выделена стандартным фенольным методом с протеиназой К.
Международное нормализованное отношение (МНО) определяли с помощью тромбопластина фирмы «Технологический стандарт» (Россия) с индексом чувствительности (МИЧ) 1,3.
Статистическая обработка. Статистическую обработку выполняли методами параметрической (t критерий Стьюдента, критерий χ2) и непараметрической статистики (метод Манна-Уитни, Уилкоксона, критерий Фишера) с помощью пакетов статистически программ Biostat, Statistica 6.0. (PPV) и отрицательного (NPV) результатов рассчитывали по общепринятым формулам.
Результаты собственных исследований
1.1 Изучение частоты аллелей и генотипов по полиморфному маркеру С1173Т гена VKORС1 у больных с постоянной формой фибрилляции предсердий в сравнении со здоровыми лицами
Изучение частот аллелей и генотипов по полиморфному маркеру С1173Т гена VKORС1 у больных с постоянной формой фибрилляции предсердий. В результате генотипирования 172 пациентов с ИБС и постоянной формой фибрилляции предсердий, по полиморфному маркеру С1173Т гена VKORC1 были получены следующие результаты:
· Пациенты, несущие генотип СС по полиморфному маркеру С1173Т гена VKORC1- 60 человек;
· Пациенты, несущие генотип СТ по полиморфному маркеру С1173Т гена VKORC1- 82 человека;
· Пациенты, несущие генотип ТТ по полиморфному маркеру С1173Т гена VKORC1- 30 человек.
Были получены следующие частоты генотипов полиморфному маркеру С1173Т гена VKORC1 у пациентов с ИБС и постоянной формой фибрилляции предсердий (рисунок 1.1):
· генотип СС полиморфному маркеру С1173Т гена VKORC1-34,8%;
· генотип СТ полиморфному маркеру С1173Т гена VKORC1- 47,7%;
· генотип ТТ полиморфному маркеру С1173Т гена VKORC1- 17,5%.
Рисунок 1.1. Распределение (в %) генотипов по полиморфному маркеру С1173Т гена VKORC1 у пациентов с ИБС и постоянной формой фибрилляцией предсердий.
В ходе генотипирования 172 пациентов с ИБС и постоянной формой фибрилляции предсердий по полиморфному маркеру С1173Т гена VKORC1 было проанализировано 344 аллеля и выявлено:
· С аллель по полиморфному маркеру С1173Т гена VKORC1- 202 аллелеля;
· Т аллель по полиморфному маркеру С1173Т гена VKORC1- 142 аллеля.
Были получены следующие частоты аллелей по полиморфному маркеру С1173Т гена VKORC1 (рисунок 1.2):
· С аллель по полиморфному маркеру С1173Т гена VKORC1- 58,7%;
· Т аллель по полиморфному маркеру С1173Т гена VKORC1- 41,3%.
Рисунок 1.2. Распределение (в %) аллелей по полиморфному маркеру С1173Т гена VKORC1 у пациентов с ИБС и постоянной формой фибрилляцией предсердий.
Для доказательства гомогенности выборки пациентов с ИБС и постоянной формой фибрилляции предсердий, мы сопоставили распределение генотипов по полиморфному маркеру С1173Т гена VKORC1, полученное нами экспериментальным путем с теоретически рассчитанным распределением по закону Харди-Вайнберга:
р2СС+2pq+q2ТТ=1
Где р - частота С аллеля по полиморфному маркеру С1173Т гена VKORC1;
q- частота Т аллеля по полиморфному маркеру С1173Т гена VKORC1;
р2 - частота генотипа СС по полиморфному маркеру С1173Т гена VKORC1;
q2 – частота генотипа ТТ по полиморфному маркеру С1173Т гена VKORC1;
2pq- частота генотипа СТ по полиморфному маркеру С1173Т гена VKORC1.
Экспериментальное и рассчитанное теоретически по закону Харди-Вайнберга распределение генотипов по полиморфному маркеру С1173Т гена VKORC1 представлено в таблице 1.1.
Таблица 1.1
Экспериментальное и рассчитанное теоретически распределение генотипов по полиморфному маркеру С1173Т гена VKORC1 у пациентов с ИБС и постоянной формой фибрилляции предсердий
Аллели / генотипы | Обозначение и формула расчета | Частоты аллелей / генотипов | |
По закону Харди-Вайнберга (теоретически) | По данным исследования (экспериментально) | ||
С | р | 0,587 | |
Т | q | 0,413 | |
СС | р2 | 0,345 | 0,348 |
СТ | 2pq | 0,485 | 0,477 |
ТТ | q2 | 0,170 | 0,175 |
р>0,05 (тест χ2), различия статистически не достоверны |
При сравнении с помощью критерия χ2 частот генотипов по полиморфному маркеру С1173Т гена VKORC1 (генотипы СС, СТ и ТТ), полученных экспериментально и рассчитанных теоретически, статистически значимых различий не было. Это свидетельствует о гомогенности выборки пациентов с ИБС и постоянной формой фибрилляции предсердий.
Изучение частот аллелей и генотипов по полиморфному маркеру С1173Т гена VKORС1 у здоровых лиц. В результате генотипирования 102 здоровых лиц, по полиморфному маркеру С1173Т гена VKORC1 были получены следующие результаты:
· Лица, несущие генотип СС по полиморфному маркеру С1173Т гена VKORC1- 37 человек;
· Лица, несущие генотип СТ по полиморфному маркеру С1173Т гена VKORC1- 46 человека;
· Лица, несущие генотип ТТ по полиморфному маркеру С1173Т гена VKORC1- 19 человек.
Были получены следующие частоты генотипов полиморфному маркеру С1173Т гена VKORC1 у здоровых лиц (рисунок 1.3):
· генотип СС полиморфному маркеру С1173Т гена VKORC1-36,3%;
· генотип СТ полиморфному маркеру С1173Т гена VKORC1- 45,1%;
· генотип ТТ полиморфному маркеру С1173Т гена VKORC1- 18,6%.
Рисунок 1.3. Распределение (в %) генотипов по полиморфному маркеру С1173Т гена VKORC1 у здоровых лиц.
В ходе генотипирования 102 здоровых лиц по полиморфному маркеру С1173Т гена VKORC1 было проанализировано 204 аллеля и выявлено:
· С аллель по полиморфному маркеру С1173Т гена VKORC1- 120 аллелеля;
· Т аллель по полиморфному маркеру С1173Т гена VKORC1- 82 аллеля.
Были получены следующие частоты аллелей по полиморфному маркеру С1173Т гена VKORC1 (рисунок 1.4):
· С аллель по полиморфному маркеру С1173Т гена VKORC1- 59,4%;
· Т аллель по полиморфному маркеру С1173Т гена VKORC1- 40,6%.
Рисунок 1.4. Распределение (в %) аллелей по полиморфному маркеру С1173Т гена VKORC1 у здоровых лиц.
Как и в случае с выборкой пациентов с ИБС и постоянной формой фибрилляции предсердий, для доказательства гомогенности выборки здоровых добровольцев, мы сопоставили распределение генотипов по полиморфному маркеру С1173Т гена VKORC1, полученное нами экспериментальным путем с теоретически рассчитанным распределением по закону Харди-Вайнберга.
Экспериментальное и рассчитанное теоретически по закону Харди-Вайнберга распределение генотипов по полиморфному маркеру С1173Т гена VKORC1 представлено в таблице 1.2.
Таблица 1.2
Экспериментальное и рассчитанное теоретически распределение генотипов по полиморфному маркеру С1173Т гена VKORC1 у здоровых лиц
Аллели / генотипы | Обозначение и формула расчета | Частоты аллелей / генотипов | |
По закону Харди-Вайнберга (теоретически) | По данным исследования (экспериментально) | ||
С | р | 0,594 | |
Т | q | 0,406 | |
СС | р2 | 0,353 | 0,363 |
СТ | 2pq | 0,482 | 0,451 |
ТТ | q2 | 0,165 | 0,186 |
р>0,05 (тест χ2), различия статистически не достоверны |
При сравнении с помощью критерия χ2 частот генотипов по полиморфному маркеру С1173Т гена VKORC1 (генотипы СС, СТ и ТТ), полученных экспериментально и рассчитанных теоретически, статистически значимых различий у здоровых лиц не было. Это свидетельствует о гомогенности выборки здоровых лиц.
Анализируя литературные данные по частотам аллелей и генотипов по полиморфному маркеру С1173Т гена VKORС1 в российской популяции (у больных с ИБС и постоянной формой фибрилляции предсердий и у здоровых), мы выяснили, что полученные нами данные сопоставимы с данными исследований Reitsma и соавт. (2005) Schalekamp и соавт. (2006), выполненных у жителей Нидерландов. Это согласуется с результатами других многочисленных исследований, демонстрирующих схожесть распределение частот аллелей и генотипов по аллельным вариантам других генов, ответственных за изменение фармакологического ответа и в частности генов, кодирующих изоферменты цитохрома Р-450, гликопротеин-Р и др. [Ozawa S и соавт. 2004]. Это касается и аллельных вариантов гена CYP2C9, носительство которых ассоциируется с повышенной чувствительности к непрямым актикоагулянтам [Gaikovitch EA и соавт. 2004].
Сравнение частот аллелей и генотипов по полиморфному маркеру С1173Т гена VKORС1 у больных с постоянной формой фибрилляции предсердий со здоровыми лицами. Сравнение частот генотипов по полиморфному маркеру С1173Т гена VKORС1 у больных с постоянной формой фибрилляции предсердий со здоровыми лицами проводили с помощью критерия χ2 (таблица 1.3, рисунок 1.5).
Таблица 1.3
Частоты (%) генотипов по полиморфному маркеру С1173Т гена VKORС1 у больных с постоянной формой фибрилляции предсердий и у здоровых лиц
Генотип | Больные | Здоровые |
СС | 34,8% | 36,3% |
СТ | 47,7% | 45,1% |
ТТ | 17,5% | 18,6% |
р>0,05 (тест χ2), различия статистически не достоверны |
Рисунок 1.5. Сравнение частоты генотипов по полиморфному маркеру С1173Т гена VKORС1 у больных с постоянной формой фибрилляции предсердий и у здоровых лиц.
Из таблицы 1.3 видно, что выявлено отсутствие достоверных различий в частотах генотипов по полиморфному маркеру С1173Т гена VKORC1 у больных с ИБС и постоянной формой фибрилляции предсердий и у здоровых лиц.
Мы сравнили частоты аллелей по полиморфному маркеру С1173Т гена VKORС1 у больных с постоянной формой фибрилляции предсердий со здоровыми лицами с помощью критерия χ2 (таблица 1.4, рисунок 1.6).
Таблица 1.4
Частоты (%) аллелей по полиморфному маркеру С1173Т гена VKORС1 у больных с постоянной формой фибрилляции предсердий и у здоровых лиц
Генотип | Больные | Здоровые |
С | 58,7% | 59,4% |
Т | 41,3% | 40,6% |
р>0,05 (тест χ2), различия статистически не достоверны |
Рисунок 1.6. Сравнение частоты аллелей по полиморфному маркеру С1173Т гена VKORС1 у больных с постоянной формой фибрилляции предсердий и у здоровых лиц.
Из таблицы 1.4 видно, что выявлено отсутствие достоверных различий в частотах аллелей по полиморфному маркеру С1173Т гена VKORC1 у больных с ИБС и постоянной формой фибрилляции предсердий и у здоровых лиц.
Reitsma и соавт. (2005), Schalekamp и соавт. (2006) высказывали предположения о том, что у лиц с генотипом СС по полиморфному маркеру С1173Т гена VKORC1 снижена его эскпрессия по сравнению с лицами с генотипами СТ и ТТ. В связи с этим можно было бы ожидать склонность к тромбофилий у этой категории пациентов и как следствие повышение риска развития заболеваний, связанных с атеротромбозом, однако нами было показано что частоты генотипов по полиморфному маркеру С1173Т гена VKORC1 не статистически значимо не различаются у больных с ИБС и постоянной формой фибрилляции предсердий и у здоровых лиц, что ставит эту гипотезу под сомнение. А в практическом плане позволяет сделать заключение о том, что данные о частотах аллелей и генотипов по полиморфным маркерам гена VKORC1, полученные у здоровых можно переносить на больных с сердечно-сосудистыми заболеваниями.
Выводы
1. Частоты генотипов СС, СТ и ТТ полиморфному маркеру С1173Т гена VKORC1 у больных ИБС и постоянной формой фибрилляции предсердий составляют 34,8%, 47,7% и 17,5%, соответственно и статистически достоверно не различаются по сравнению со здоровыми лицами.
2. У носителей генотипа ТТ по полиморфному маркеру С1173Т гена VKORС1 подобранная доза варфарина был ниже по сравнению с носителями генотипа СС (2,64±1,95 vs 8,52±2,91, р=0,0001) и СТ (2,64±1,95 vs 5,56±1,36, р=0,005). У пациентов с генотипом ТТ по полиморфному маркеру С1173Т гена VKORС1 подобранная доза аценокумарола была статистически значимо ниже по сравнению с подобранной дозой аценокумарола у пациентов с генотипом СС (1,32±0,81 vs 2,78±0,71, р=0,01) и генотипом СТ (1,32±0,81 vs 2,21±0,45, р=0,05).
3. У пациентов с генотипом ТТ по полиморфному маркеру С1173Т гена VKORС1 чаще развивались эпизоды чрезмерной гипокоагуляции по сравнению с больными с генотипами СТ и СС (90% vs 58% и 90% vs 24%, соответственно, χ2= 12,764, р=0,002). У пациентов с генотипом ТТ по полиморфному маркеру С1173Т гена VKORС1 чаще развивались эпизоды чрезмерной гипокоагуляции при применении аценокумарола по сравнению с больными с генотипами СТ и СС (83% vs 54% и 83% vs 32%, соответственно, χ2= 7,930, р=0,02).
4. У пациентов с генотипом ТТ по полиморфному маркеру С1173Т гена VKORС1 чаще развивались кровотечения по сравнению с больными с генотипами СТ и СС (80% vs 12% и 80% vs 10%, соответственно, χ2= 24,821, р=0,0001). У пациентов с генотипом ТТ по полиморфному маркеру С1173Т гена VKORС1 чаще развивались кровотечения при применении аценокумарола по сравнению с больными с генотипами СТ и СС (75% vs 15% и 75% vs 11%, соответственно, χ2= 18,713, р=0,0001).
Практические рекомендации
1. Рекомендуется определять носительство генотипов по полиморфному маркеру С1173Т гена VKORС1, наряду с носительством аллельных вариантов CYP2C9*2 и CYP2C9*3 всем больным, которым планируется назначение непрямых антикоагулянтов варфарина и аценокумарола.
2. Рекомендуется выбирать начальные дозы варфарина и аценокумарола в зависимости от генотипа по полиморфному маркеру С1173Т гена VKORС1 по следующему алгоритму:
· При выявлении ТТ генотипа начальная доза варфарина должна составлять 2,5 мг/сутки, аценокумарола - 1 мг/сутки;
· При выявлении СТ генотипа начальная доза варфарина должна составлять 5 мг/сутки, +аценокумарола - 2 мг/сутки;
При выявлении СС генотипа начальная доза варфарина должна составлять 7,5 мг/сутки, аценокумарола - 2,5 мг/сутки
Список работ, опубликованных по теме диссертации :
· 1 , , - Генетическая основа кумаринорезистентности : новое понимание старой проблемы. // Ведомости научного центра экспертизы средств медицинского применения – 2006.-№2 с.50-52.
· 2 , , Кукес тестирование как реальная возможность повышения безопасности при применении непрямых антикоагулянтов. // Научный журнал Биомедицина-2006.-№3 с.117-118.
· 3 , , Цветков изомерического балласта и безопасность лекарст. // Научный журнал Биомедицина-2006.-№2 с.126-128.
· 4 , , Сычев кумаринорезистентности у больного с постоянной формой мерцательной аритмии. // Материалы научно-практической конференции “Клинико-фармакологические подходы в оптимизации фармакотерапии” -2006. –с.21-22.
· 5 , , Загорская основа кумаринорезистентности: новый взгляд на старый фармакогенетический феномен. // Медицинская генетика.- 2006.- №5.- с. 9-11.
