Характеристика культивируемых гетеротрофов микробного сообщества кишечника дальневосточного трепанга apostichopus japonicus (стр. 1 )

На правах рукописи

БОГАТЫРЕНКО ЕЛЕНА АЛЕКСАНДРОВНА

ХАРАКТЕРИСТИКА КУЛЬТИВИРУЕМЫХ ГЕТЕРОТРОФОВ МИКРОБНОГО СООБЩЕСТВА КИШЕЧНИКА ДАЛЬНЕВОСТОЧНОГО ТРЕПАНГА APOSTICHOPUS JAPONICUS

03.02.08 – экология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Владивосток, 2013

Работа выполнена на кафедре экологии Школы естественных наук Дальневосточного федерального университета, г. Владивосток

Научный руководитель:	доктор биологических наук, профессор
Официальные оппоненты:	доктор биологических наук, член – корреспондент РАЕ, зав. кафедрой анатомии и ветеринарно-санитарной экспертизы, профессор ФГБОУ ВПО «Иркутская государственная сельскохозяйственная академия» кандидат биологических наук, ст. научный сотрудник лаборатории водной микробиологии Лимнологического института СО РАН
Ведущая организация:	ФГБОУ ВПО "Дальрыбвтуз"

Защита диссертации состоится 30 мая 2013 г. в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 212.074.07 при ФГБОУ ВПО «Иркутский государственный университет» г. Иркутск, , ауд. 219.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИГУ г. Иркутск, .

Отзывы просим направлять ученому секретарю диссертационного совета , биолого-почвенный факультет ИГУ. Тел. / ; e-mail: *****@***com.

Автореферат разослан «30» апреля 2013 года.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

кандидат биологических наук,

доцент

Актуальность работы. Дальневосточный трепанг Apostichopus japonicus относится к важным объектам промысла в морях Дальнего Востока, являясь одним из самых дорогих и востребованных на международном рынке морепродуктов. Несмотря на то, что у побережья Китая обитает около 20 видов голотурий, в том числе и таких коммерчески важных, как Thelenota ananas, Actinopyga miliaris, Holothuria nobilis, наиболее высоко ценится продукт, получаемый именно из дальневосточного трепанга, поэтому он пользуется повышенным спросом в Китае, Корее, Японии. Ткани гидробионта содержат богатый набор биологически активных химических соединений, что обуславливает высокую фармакологическую ценность получаемых из трепанга продуктов (Левин, 2000). Пищевая и целебная ценность голотурии привела к интенсификации промысла и несоблюдению норм вылова, а с начала 90-х годов прошлого столетия, и к массовому браконьерскому вылову дальневосточного трепанга, что, в конечном счете, сказалось на значительном сокращении численности популяций этого животного во всех районах его обитания. При наметившейся тенденции уменьшения запасов данного биоресурса вполне очевидно, что за счет естественного воспроизводства численность беспозвоночного восстановиться не сможет, что в итоге приведет к исчезновению вида Apostichopus japonicus (Сергеенко, Дубровский, 1994).

На сегодняшний день одним из способов восстановления численности популяции дальневосточного трепанга является марикультура. В Приморском крае России уже существуют десятки акваферм, занимающихся искусственным разведением голотурии. Одной из ключевых проблем подобных морских хозяйств является высокая смертность трепанга на ранних стадиях его развития, что, по мнению некоторых ученых, связано со снижением иммунитета гидробионта и его подверженности различным инфекционным заболеваниям из-за постоянно действующих факторов стресса: высоких нагрузок биомассы на единицу объёма, органических загрязнений воды, перепадов концентрации кислорода (Захарова, Шатковская, 2008). Тем не менее, в литературе отсутствуют данные о влиянии искусственных условий воспроизводства на изменение состава и численности бактериальных сообществ кишечной микрофлоры трепанга, также как и отсутствуют данные о составе нормальной кишечной микрофлоры этого гидробионта. Известно, что дальневосточный трепанг по способу питания является детритофагом-грунтоедом, и в среднем за год через его кишечник проходит огромное количество грунта вместе с различными микроорганизмами и останками морских растений и животных (Левин, 1982). Таким образом, становится очевидным огромное значение собственной микрофлоры трепанга в переработке и усвоении попадающей с пищей органики.

Как показывает зарубежный и отечественный опыт, одним из наиболее перспективных способов снижения смертности промысловых видов рыб, моллюсков и ракообразных при их искусственном разведении является использование препаратов на основе пробиотиков, которые представляют собой живые организмы и (или) вещества микробного или иного происхождения, повышающие активность иммунной системы, принимающие активное участие в процессах пищеварения, способствующие восстановлению естественной микрофлоры (Бурлаченко и др., 2006). В настоящее время известно несколько механизмов положительного воздействия пробиотиков на организм, одним из которых является синтез пищеварительных ферментов, улучшающих деятельность желудочно-кишечного тракта (Verschuere et al., 2000).

На сегодняшний день в литературе наиболее полно описаны эколого-географические аспекты использования ресурсов Apostichopus japonicus для сохранения и восстановления его численности (Лебедев, 2002). Что же касается изучения микробного сообщества кишечника дальневосточного трепанга, то информация по данному вопросу практически отсутствует. В работе (1982) приведены данные только о сезонной динамике численности бактерий в пищеварительном тракте голотурии, детрите и морской воде из мест обитания животного. О ферментативной активности выделенных из дальневосточного трепанга микроорганизмов упоминается лишь в некоторых работах, целью которых был поиск источников биологически активных ферментов (Урванцева и др., 2006; Беленева и др., 2010; Hirimuthugoda et al., 2007).

Цель данной работы - изучить качественный, количественный состав и биохимические свойства бактериального сообщества кишечника дальневосточного трепанга из естественной среды обитания.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1.  Дать сравнительную характеристику численности и видового состава культивируемых гетеротрофных бактерий, выделенных из кишечников трепангов б. Алексеева и б. Киевка Японского моря.

2.  Дать сравнительную характеристику численности и видового состава культивируемых гетеротрофных бактерий, выделенных из грунтов с мест обитания трепангов б. Алексеева и б. Киевка Японского моря.

3.  Изучить активность пищеварительных ферментов бактерий, выделенных из кишечника трепанга.

Научная новизна работы. Впервые изучены видовой состав и численность культивируемых бактерий, входящих в состав кишечной микрофлоры дальневосточного трепанга. Установлено, что бактериальное сообщество кишечника трепанга формируется за счет микробиоты грунта из мест обитания голотурии.

Впервые представлена качественная и количественная характеристика амилолитической, хондроитинсульфатазной, хитинолитической, альгинатлиазной, липолитической и протеолитической активности кишечной микрофлоры трепанга.

Практическая значимость работы. Впервые получена коллекция штаммов бактерий, населяющих кишечник дальневосточного трепанга Apostichopus japonicus. Полученные микроорганизмы обладают высокой биохимической активностью, что делает их весьма ценными для использования в биотехнологии. Кроме того, ряд выделенных штаммов с высокими значениями активности пищеварительных ферментов, рекомендован для применения в качестве пробиотиков при искусственном разведении голотурий. Фрагменты работы используются в качестве материалов для лекций учебной дисциплины «Морская микробиология» и летней практики студентов Дальневосточного федерального университета.

Защищаемые положения:

1.  Видовой состав бактериального сообщества кишечника дальневосточного трепанга специфичен, так как формируется за счет только факультативно анаэробных бактерий, населяющих грунты в местах обитаний голотурии.

2.  Бактерии кишечной микрофлоры трепанга характеризуются высокой активностью пищеварительных ферментов как потенциальные пробиотики для использования в марикультуре.

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на Всероссийской научной школе для молодежи «Перспективы развития инноваций в биологии», г. Владивосток, 2009; IX региональной конференции студентов, аспирантов вузов и научных организаций Дальнего Востока России «Актуальные проблемы экологии, морской биологии и биотехнологии», г. Владивосток, 2010; I Дальневосточной междисциплинарной молодежной научной конференции «Современные методы научных исследований», г. Владивосток, 2011;
3-ем Байкальском микробиологическом симпозиуме с международным участием «Микроорганизмы и вирусы в водных экосистемах», г. Иркутск, 2011; XIII международной научно-практической конференции "Фундаментальные и прикладные исследования, разработка и применение высоких технологий в промышленности и экономике", Санкт-Петербург, 2012. Результаты исследований были представлены на VI Межрегиональной экологической научно-практической конференции «Экологические аспекты региона», г. Воронеж, 2010; Всероссийской конференции молодых ученых и специалистов, посвященная 125-летию со дня рождения , г. Мурманск, 2010; I Международной научно-практической конференции «Экологическая безопасность и устойчивое развитие территорий», Чебоксары, 2011.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ, в том числе 2 статьи, опубликованные в ведущих рецензируемых журналах.

Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения; обзора литературы, посвященного актуальности искусственного воспроизводства дальневосточного трепанга, проблемам, связанным с его культивированием, а также международному опыту успешного применения пробиотиков в марикультуре; главы, содержащей описание использованных в работе материалов и методов; двух экспериментальных глав, посвященных изучению бактериального состава микрофлоры кишечника трепанга, а также характеристике активности пищеварительных ферментов, полученных из него штаммов бактерий; выводов; списка литературы, который включает 147 источника, в том числе 83 иностранных, и 19 приложений.

Диссертация изложена на 128 страницах, иллюстрирована 8 рисунками, 9 таблицами и 19 приложениями. Данная работа выполнена при финансовой поддержке фондов Министерства образования и науки по проектам: 1.2.09; АВЦП 2.1.1./4793; Правительства РФ для государственной поддержки научных исследований, проводимых под руководством ведущих ученых в российских образовательных учреждениях высшего профессионального образования, дог. № 11.G34.31.0010

Благодарности. Автор искренне благодарит своего научного руководителя , д. б.н., профессора за всестороннюю помощь, поддержку и за помощь в освоении экспериментальных методов, а также ценные консультации на всех этапах работы. Особую благодарность автор выражает профессору Чши Чжемину, заведующему лаборатории морских микроорганизмов Океанологического университета г. Циндао (Китая), а также всем сотрудникам указанной лаборатории за помощь в проведении экспериментов и постоянный интерес к работе.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. Обзор литературы

В главе описаны морфология, биология, экология дальневосточного трепанга, подчеркнута актуальность проблемы сокращения численности природной популяции животного за счет браконьерства, а так же рассмотрены особенности и проблемы культивирования трепанга в искусственных условиях. Изучены различные классификации пробиотиков, показаны механизмы их положительного воздействия на организм хозяина. Проанализирован опыт успешного применения пробиотиков при искусственном разведении гидробионтов.

Глава 2. Материалы и методы

Выделение и идентификация микрофлоры дальневосточного трепанга и грунта из мест его обитания. Для проведения исследований по изучению свойств микрофлоры дальневосточного трепанга (Apostichopus japonicus) в августе 2004 и 2006 г. г. на глубине 5-10 м было собрано 10 взрослых особей голотурии (по 5 из каждого района) из б. Алексеева и б. Киевка Японского моря (Приморский край России). Одновременно с этим, в указанных районах были отобраны пробы грунта в местах обитания трепангов. В условиях стерильности кишечники трепангов были извлечены с помощью скальпеля и гомогенизированы. Гомогенат тканей и суспензию грунта после серийных разведений высевали на агаризованную питательную среду СММ (среда для морских микроорганизмов) и культивировали в термостате при температуре 25ºC в течение двух суток (Youchimizu, Kimura, 1976). После этого различные по морфологии одиночные колонии подсчитывали, а затем откалывали с помощью микробиологической петли и пересевали на чашки с той же средой для получения чистых культур. Численность микроорганизмов выражали в КОЕ/г массы сухого гомогената ткани кишечника или грунта.

Идентификацию полученных штаммов бактерий проводили на основе морфологических, культуральных и физиолого-биохимических свойств. Отдельно выбранные штаммы были идентифицированы с помощью готовых биохимических API - тестов производства компании bioMerieux (Франция). Для подтверждения таксономического статуса некоторые штаммы идентифицировали с применением анализа последовательностей 16S рРНК генов.

Дальнейшая работа по изучению ферментативной активности микроорганизмов проводилась путём посева штаммов на плотные и жидкие среды с хитином, крахмалом, хондроитинсульфатом, альгинатом натрия, твинами 40 и 80, оливковым маслом, казеином и желатином.

Определение активности амилаз и хондроитинсульфатаз. Для качественного определения амилолитической и хондроитинсульфатазной активности исследуемые штаммы были высеяны на чашки с агаризованными минерально-солевыми средами, содержащими крахмал и хондроитинсульфат соответственно. Культивирование микроорганизмов проводили в термостате при температуре 25◦С трое суток, после чего в чашки с крахмальной средой добавляли раствор Люголя и отмечали появление светлых колец вокруг колоний, свидетельствующее о наличии амилаз, а на среде с хондроитинсульфатом фиксировали образование зон гидролиза субстрата вокруг посева бактерий. Для количественной оценки продуктивности ферментов из суточных культур бактерий, проявивших активность на плотной среде, готовили взвеси, которые вносили в жидкую СММ, и выращивали на качалке при 25ºС в течение двух суток. Активности ферментов измеряли по методу Шомодьи (Somogyi, 1952).

Определение хитинолитической активности. Хитиназную активность учитывали в динамике (через 2, 4, 7 и 9 дней) по зонам просветления вокруг посева на агаризованной среде, содержащей в качестве единственного источника углерода и азота коллоидный хитин. Для дальнейшего изучения свойств бактерий, проявивших активность на плотной среде, приготовленные из суточных культур бактериальные взвеси вносили в жидкую питательную среду, содержащую нативный хитин (10 г/л), и выращивали на качалке при 25ºС в течение 9 суток (Слабоспицкая, Крымовская, 1992). Хитинолитическую активность определяли в динамике через 2, 4, 7 и 9 суток, используя модифицированный колориметрический метод оценки количества
N-ацетиламиносахаров (Reissing et al., 1955).

Определение активности альгинатлиаз. Для качественной оценки альгинатлиазной активности использовали агаризованную питательную среду с альгинатом натрия и учитывали в динамике через 2, 3 и 4 суток степень гидролиза субстрата вокруг посева (в мм). Из суточных культур бактерий, проявивших активность на плотной среде, готовили бактериальные взвеси, которые вносили в жидкую среду с альгинатом натрия (10 г/л) и выращивали на качалке при 25ºC 4 суток (Kitamikado et al., 1990). Активность фермента определяли в культуральной жидкости, полученной после центрифугирования, визкозиметрическим методом по изменению вязкости 0.3%-ого раствора альгината натрия, приготовленного на трис-HCL - буфере с добавлением 1.9% NaCl.

Определение липолитической активности. Для качественного определения липолитической активности исследуемые штаммы были высеяны на чашки с агаризованными средами со специфическими субстратами в качестве источника углерода. Образование и активность ферментов липолитического комплекса оценивали по появлению отчетливых зон деэтерифицированного субстрата: оливкового масла или твинов 40 и 80 (по 0.5%), после трехсуточного инкубирования при 25◦С на МПА с добавлением CaCl2 (Ota et al., 1966). Для количественной оценки липолитической активности бактериальные культуры выращивали в колбах емкостью 750 мл в условиях аэрации на качалке (200 об/мин) при 25◦С в течение 3х суток с 50мл жидкой синтетической среды с добавлением оливкового масла или твинов (0.5% в 1/15 М фосфатном буфере, pH 7.0). По окончании ферментации в бесклеточном фильтрате определяли активность липаз титрометрическим методом с использованием 40% эмульсии оливкового масла в 2% водном растворе поливинилового спирта (Ota et al., 1966).

Определение протеолитической активности. Для качественной оценки протеолитической активности исследуемые штаммы высевали на агаризованную среду Пфеннига (Поляк и др., 2002) с добавлением 1.5% казеина или 1.5% желатина. Культивирование микроорганизмов проводили в термостате при температуре 25◦С трое суток, после чего фиксировали образование зон гидролиза субстрата вокруг посева бактерий. Для количественной оценки продуктивности ферментов из суточных культур бактерий, проявивших активность на плотной среде, готовили взвеси (2 млрд. микробных тел в 1 мл), которые вносили в жидкую СММ, и выращивали на качалке при 25ºС в течение двух суток. Активность ферментов определяли спектрофотометрическим методом. В качестве белкового субстрата использовали 1% казеин или 1% желатина.

Статистическая обработка данных. Статистическая обработка данных проводилась с помощью программы Statistica 6.0. Сходство таксономического состава микробных сообществ грунтов и кишечников трепангов из районов исследования изучали с помощью коэффициента Жаккара (Елисеева, Рукавишников, 1977). Значения уровней ферментативной активности кишечной микрофлоры трепангов из б. Алексеева и б. Киевка сравнивали с помощью
U-критерия Уитни-Манна (Гублер, Генкин, 1973).

Глава 3. Сравнительная характеристика бактериального состава и численности кишечной микрофлоры дальневосточного трепанга и грунта из мест его обитания

3.1.Идентификация культивируемых бактерий микрофлоры дальневосточного трепанга и грунта из мест его обитания

В ходе исследований из дальневосточного трепанга Apostichopus japonicus и из грунта, отобранного из мест обитания голотурии, выделено и таксономически охарактеризовано в общей сложности 139 штаммов бактерий (67 и 72 соответственно). Среди кишечной микрофлоры трепангов и грунтов из мест обитания голотурий оказались представители следующих родов бактерий: Acinetobacter, Aeromonas, Arthrobacter, Bacillus, Enterobacter, Flavobacterium, Flexibacter, Halomonas, Micrococcus, Pseudoalteromonas, Pseudomonas, Vibrio. Часть микроорганизмов, выделенных из кишечника трепанга удалось идентифицировать до вида с вероятностью 86-99%: Aeromonas hydrophila, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus subtilis, Enterobacter hormaechei, Enterobacter intermedius, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas maltophilia, Pseudomonas putida.

Для подтверждения таксономического статуса некоторые штаммы были идентифицированы сотрудниками генетической лаборатории Дальневосточного федерального университета (Владивосток) с применением анализа последовательностей 16S рРНК генов.

3.2. Характеристика состава и численности кишечной микрофлоры трепанга и грунта из мест его обитания

Из кишечников гидробионтов б. Алексеева было выделено 28 штаммов бактерий, из них большинство (78.6%) грамотрицательные. Микрофлора голотурий этого района характеризуется большим разнообразием представителей рода Pseudomonas – 14 штаммов. Псевдомонады составили 50% от таксономического разнообразия бактерий, полученных из пищеварительного тракта животных указанного района. Остальная доля была представлена бактериями родов Aeromonas, Bacillus, Enterobacter, Micrococcus и Vibrio (рис. 1). Общая численность гетеротрофов для данного сообщества составила 2.6·108 КОЕ/г (рис. 5).

Из кишечников трепангов, отобранных из б. Киевка было выделено 39 штаммов микроорганизмов, большинство из которых (51.3%) отнесены к грамположительным бактериям. В микрофлоре голотурий данного района обнаружено 18 штаммов различных видов рода Bacillus, что составило 46.16% от общего количества полученных изолятов. Помимо бацилл, в исследуемых образцах было зафиксировано присутствие представителей тех же родов, что и в микрофлоре трепангов б. Алексеева, а также штаммы бактерий, отнесенные к Flavobacterium, Halomonas и Pseudoalteromonas (рис. 2). Проведенный анализ полученных данных показал, что коэффициент сходства Жаккара (Kj) для бактериальных сообществ кишечников трепангов из двух районов оказался довольно высоким - 0.7. Богатый видовой состав микробного сообщества, населяющего кишечник голотурий б. Киевка, возможно, связан с более высоким содержанием органического вещества в песчано-илистых грунтах б. Киевка по сравнению с каменисто-песчаными грунтами б. Алексеева (Нестерова, 2005).

Преобладание в б. Киевка представителей рода Bacillus, а не Pseudomonas, скорее всего, объясняется тем, что бациллы – преимущественно почвенные микроорганизмы, и в морскую среду могут поступать вместе с терригенными стоками (Исаченко, 1937), а в б. Киевка впадает река с одноименным названием, которая вносит в море микрофлору почвенного слоя.

В ходе исследования микрофлоры грунта из мест отбора голотурий б. Алексеева было получено 33 штамма бактерий, большинство из которых (81.8%) является грамотрицательными. Как и в случае состава микрофлоры трепангов данного района, по количеству выделенных видов в пробах преобладали представители рода Pseudomonas (18 штаммов), а также присутствовали Aeromonas, Bacillus, Enterobacter, Micrococcus и Vibrio (рис. 3). Таким образом, Kj =1, что означает полное сходство составов микрофлоры трепанга и грунта из б. Алексеева. Единственное различие заключалось в численности полученных микроорганизмов, а именно численность в грунте была на порядок ниже таковой в пищеварительном тракте животных (рис.5). Полученные данные дают основание говорить о том, что есть прямая связь между микрофлорой грунта и кишечника голотурий, которые по способу питания являются детритофагами-грунтоедами. Бактерии, попадая вместе с грунтом в организм беспозвоночного, получают преимущество перед свободноживущими организмами за счет непрерывного поступления доступного органического вещества, что обуславливает их интенсивное размножение в организме хозяина.

Рис. 1. Таксономический состав культивируемого бактериального сообщества кишечника трепанга б. Алексеева; Рис. 2. Таксономический состав культивируемого бактериального сообщества кишечника трепанга б. Киевка

Рис. 3. Таксономический состав культивируемого бактериального сообщества грунта б. Алексеева; Рис. 4. Таксономический состав культивируемого бактериального сообщества грунта б. Киевка

Аналогичные данные были получены и для б. Киевка. Из грунта этого района выделено 39 штаммов микроорганизмов, большинство из которых (51.3%) отнесено к грамположительным бактериям. В микробном сообществе преобладали представители рода Bacillus (16 штаммов), и отмечался практически тот же видовой состав бактерий, что и в кишечнике беспозвоночных (рис. 4). Коэффициент сходства микрофлоры кишечника трепанга и грунта оказался равен 0.75, микрофлоры грунтов двух районов – 0.5. Общая численность полученных из грунта гететрофных микроорганизмов (9.7·106 КОЕ/г) была ниже таковой из трепанга (2.7·108 КОЕ/г) (рис. 6).

В образцах грунта были найдены представители родов Flexibacter, Arthrobacter и Acinetobacter (рис. 4). Отсутствие указанных бактерий в кишечнике трепангов говорит о том, что, несмотря на их присутствие в среде, данные микроорганизмы не вступают с голотуриями в симбиотические отношения. Одной из причин этого может быть отсутствие подходящих факторов для их развития. Эти микроорганизмы являются строгими аэробами, что ограничивает их жизнедеятельность в условиях низкой концентрации кислорода в пищеварительном тракте животных. Поэтому данные виды развиваются, скорее всего, только на поверхности грунта при более насыщенной аэрации.

Рис. 5. Общая численность культивируемых гетеротрофов бактериального сообщества кишечника трепанга и грунта из б. Алексеева; Рис. 6. Общая численность культивируемых гетеротрофов бактериального сообщества кишечника трепанга и грунта б. Киевка

Глава 4. Ферментативная активность микрофлоры дальневосточного трепанга

4.1. Амилолитическая активность. Из 67-ми штаммов различную степень ферментативной активности на чашках со средой, содержащей крахмал, проявили только 8, что составило около 12 % (табл. 1). Среди представителей микрофлоры трепангов б. Алексеева наличие амилолитической активности было выявлено у 3-х штаммов бактерий, идентифицированных нами как Aeromonas hydrophila А3, Pseudomonas stutzeri А8 и Enterobacter intermedius А4. Кольцо с максимальной толщиной было зафиксировано вокруг посева Aeromonas hydrophila А3 (10 мм), а с минимальной – вокруг Enterobacter intermedius А4 (4 мм); зона просветления субстрата вокруг посева Pseudomonas stutzeri А8 оказалась равной 8 мм. Из коллекции бактерий, выделенных из трепангов б. Киевка, способность расщеплять крахмал продемонстрировали 5 штаммов: Bacillus coagulans К2, Bacillus megaterium K13, Bacillus subtilis К8, Bacillus megaterium К20 и Bacillus circulans К17. Представители рода Bacillus активно разлагали субстрат, при этом размеры зон просветления среды варьировали в пределах 7–12 мм.

Дальнейшая количественная оценка активности амилаз по методу Шомодьи показала, что среди штаммов б. Алексеева наибольшей способностью расщеплять крахмал обладали штаммы Aeromonas hydrophila А3 и Pseudomonas stutzeri А8, у которых вместе с интенсивным ростом на плотной среде (зоны просветления 8 и 10 мм) отмечались и высокие значения активности амилаз, составившие 0.382 и 0.337 ед. соответственно. В то же время штамм Enterobacter intermedius А4 относительно слабо гидролизовал субстрат (толщина кольца 4 мм) и обладал низкой ферментативной активностью (0.046 ед.).

Таблица 1

Количественная оценка амилолитической активности микрофлоры трепангов из б. Алексеева и б. Киевка

б. Алексеева
Виды бактерий	Зона гидролиза субстрата вокруг колоний, мм	Активность амилаз, ед. (мкмоль/мл∙мин)
Aeromonas hydrophila А3	10	0.382 ± 0.021
Enterobacter intermedius А4	4	0.046 ± 0.009
Pseudomonas stutzeri А8	8	0.337 ± 0.011
б. Киевка
Bacillus coagulans К2	10	0.587 ± 0.016
Bacillus megaterium К13	12	0.593 ± 0.024
Bacillus subtilis К8	7	0.327 ± 0.031
Bacillus megaterium К20	9	0.455 ± 0.027
Bacillus circulans К17	8	0.441 ± 0.021

Из представителей микрофлоры трепангов б. Киевка наиболее активно гидролизовали субстрат штаммы Bacillus coagulans К2 и Bacillus megaterium К13, активность амилаз которых была равна 0.587 и 0.593 ед. соответственно. Вместе с тем, остальные 3 штамма также продемонстрировали высокие уровни расщепления крахмала (активность их амилаз составила 0.327 – 0.455 ед.), что вполне согласуется с данными, полученными на плотной среде (зоны гидролиза 7-9мм). Интересно отметить, что при анализе полученных данных с помощью критерия Манна-Уитни, используемого для малых выборок, не было выявлено статистически достоверных различий в значениях амилолитической активности бактерий из б. Алексеева и б. Киевка. U-критерий оказался равен 2 (зона незначимости), что указывает на схожие уровни ферментативной активности кишечной микрофлоры трепангов из обоих районов исследования. Способностью разлагать крахмал обладают многие виды морских бактерий, активность которых, как правило, измеряется 0.001 – 1.343 ед. (мкмоль/мл мин)(Wonger, 2003). Сравнив полученный материал с литературными данными, мы пришли к выводу, что все исследованные нами штаммы, кроме Enterobacter intermedius А4, обладают высокой способностью использовать крахмал в качестве источника энергии, что делает их весьма перспективными при оценке их возможных пробиотических свойств.