На правах рукописи
Бактериальная транслокация при острой обтурационной непроходимости кишечника.
(экспериментальное исследование).
14.00.27 – хирургия
АВТОРЕФЕРАТ
Диссертации на соискание учёной степени
кандидата медицинских наук
Москва – 2007
Работа выполнена в ГОУ ВПО Московской медицинской академии
им. и в Сургутском государственном университете
Научный руководитель
доктор медицинских наук,
профессор Александр Николаевич Афанасьев
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук,
профессор Евгений Михайлович Липницкий
доктор медицинских наук,
профессор Нана Николаевна Хачатрян
Ведущая организация: Российский государственный
медицинский университет
Защита состоится «_____» ______________ 2007 г. в _____ часов на заседании Диссертационного 208.040.03 при ГОУ ВПО Московской медицинской академии им. ( Москва, ул. Трубецкая, д. 8, стр. 2).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО ММА им. ( Москва, Нахимовский проспект).
Автореферат разослан «____» ________________ 2007 г.
Учёный секретарь
Диссертационного Совета
доктор медицинских наук,
профессор Александр Михайлович Шулутко
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.
Актуальность темы. Прогноз исхода при острой непроходимости кишечника (ОНК) во многом определяется развитием гнойно-септических осложнений, которые при прогрессировании заболевания приобретают генерализованный характер [, 1971; , , 1999; Vincent P., Colombel J. F., Lescut D. et al., 1988; Deitch E. A. 1994]. Даже в наше время, учитывая появление эффективных методов лечения, частота грозных осложнений и показатели летальности при ОНК не имеют стойкой тенденции к снижению. Причинами этого можно считать сложный механизм патогенеза заболевания, звенья которого влияют на жизненноважные системы и органы организма [, 1988; , , 1991; Deitch E. A., 1990, 1992; Bone R. C., 1994; Morrison D. S., Bucklin S. E, 1995].
Тяжесть местной и системной воспалительной реакции во многом определяется синдромом энтеральной недостаточности, который является главной причиной эндогенной интоксикации, развития синдрома системного воспалительного ответа, абдоминального сепсиса, септического шока и полиорганной недостаточности [, 1990; и др., 1991; и др., 1991; , 1997; Carrico C. J., Meakins J. L., Marshall J. L. et al., 1986; Cohen J., 1995; Lemaire L. C. et al., 1997; Balk R. 2000]. Развивающиеся критические нарушения водно-электролитного баланса, циркуляторная гипоксия кишечной стенки, дисбактериоз с проксимальной микробной колонизацией кишечника, активация реакций окислительного стресса, значительное нарушение антиоксидантной защиты, местного иммунитета и барьерной функции слизистой оболочки – вот лишь немногие из основных изменений, характеризующих этот симптомокомплекс [ и др., 1991; , , 1992; и др., 1996, 1997; , , 2001; , 2002; King C. E., Toskes P. P., 1979; Marshall J. C., Christou N. V., Meakins J. L., 1993; Deitch E. A., 1990, 1991, 1994]. В итоге создаются благоприятные условия для возникновения феномена «бактериальной транслокации», который является главным компонентом так называемого «сепсиса кишечного происхождения». При этом роль эндогенной микрофлоры является ведущей [, , 1999; , , 2001; , 2001; Berg R. D., 1985, 1996, 1999; Deitch E. A., 1989, 1990, 1994; Martinez J., 1993].
В этой связи, проводимая терапия направлена только на следствие патофизиологических нарушений, а наиболее важные патогенетические аспекты заболевания – внутрикишечная гипертензия, микробиологическая экосистема кишки, состояние её интрамурального кровотока, уровень депрессии со стороны иммунной системы слизистой, не всегда учитываются клиницистами, чем и можно объяснить известную неудовлетворённость результатами лечения [, , 1985; , , 1986; и др., 1992; и др., 2003; Marshall J. C. et al., 1988, 1996; Mainous M. R. et al., 1993; Eleftheriadis E. et al. 1996]. Поэтому комплексное изучение факторов, приводящих к транслокации эндогенной микрофлоры из просвета кишки при ОНК, представляет значительный интерес для исследования. Необходимость экспериментального анализа причин нарушения кишечного барьера при непроходимости кишечника и развития бактериальной транслокации, как основного индуктора абдоминального сепсиса в этом случае, вытекает из запросов клиники. Вот почему эти исследования актуальны для раскрытия основных звеньев патогенеза бактериальной транслокации при одном из тяжелейших хирургических заболеваний органов брюшной полости – ОНК.
Цель исследования: Цель исследования заключается в комплексном изучении факторов, приводящих к бактериальной транслокации и их взаимосвязи в эксперименте на модели острой обтурационной непроходимости кишечника, с последующим внедрением этих результатов в клиническую практику.
Задачи исследования:
1. Изучить влияние внутрикишечной гипертензии на состояние интрамуральной гемоциркуляции и её роль в развитии циркуляторно-гипоксических нарушений кишечной стенки в зависимости от сроков ОНК. 2. Исследовать морфологические изменения в кишечной стенке, мезентериальных лимфатических узлах (МЛУ), печени и лёгких через 24, 48 и 72 ч от момента обтурации.
3. Оценить влияние свободно-радикальных реакций, состояние антиоксидантной системы кишечной стенки и роль ингибитора ксантиноксидазы на характер бактериальной транслокации и проницаемость эпителиального кишечного барьера.
4. Изучить интенсивность бактериальной транслокации и определить видовой и количественный состав микроорганизмов в кишечной стенке, МЛУ, печени, лёгких, крови и перитонеальном экссудате в зависимости от сроков эксперимента.
5. Исследовать состояние местного иммунитета в кишечной стенке, МЛУ и ретикулоэндотелиальной системы печени.
Научная новизна работы: Разработана экспериментальная модель транслокации бактерий из кишечника в МЛУ, печень, лёгкие, кровеносное русло и перитонеальный экссудат при острой механической непроходимости кишечника. Изучена динамика роста внутрикишечного давления в тонкой и толстой кишке и влияние его на интрамуральную гемоциркуляцию. Определены закономерности бактериальной транслокации в кишечную стенку, мезентериальные лимфатические узлы, печень, лёгкие, а также инфицирование крови и перитонеального экссудата у животных с тонко - и толстокишечной непроходимостью в динамике патологического процесса. Произведена комплексная оценка видового и количественного состава микроорганизмов, обнаруженных в лимфатических узлах брыжейки, печени, лёгких, крови и перитонеальном экссудате. Исследован характер реакций перекисного окисления липидов (ПОЛ), активность ксантиноксидазы, как основного прооксидантного метаболита кишечной стенки и их влияние на бактериальную транслокацию.
Теоретическая и практическая значимость: На модели механической обтурационной непроходимости кишечника уже через сутки после начала эксперимента была выявлена инфицированность МЛУ, портальной крови и ткани печени. При прогрессировании патологического процесса наблюдается тенденция к системному распространению инфекции. Эти обстоятельства имеют важное клиническое значение для определения верной тактики лечения и профилактики системных гнойно-септических осложнений. Результаты бактериологических методов исследования указывают на приоритет контаминации тканей и биологических жидкостей грамотрицательной флорой, что должно учитываться в клинике при назначении рациональной антибактериальной терапии.
Внедрение результатов исследования: Основные положения работы используются в учебном и лечебном процессах в клинике общей хирургии ММА им. и ГКБ № 23 им. Медсантруд.
Положения, выносимые на защиту:
1. Нарушение проницаемости эпителиального кишечного барьера является главной причиной бактериальной транслокации при ОНК. Патоморфологические изменения барьерной функции слизистой оболочки тонкой кишки происходят раньше и они более выраженные, чем в толстой кишке.
2. На целостность слизистой оболочки кишки негативно воздействуют несколько факторов – внутрикишечная гипертензия, инициирующая циркуляторно-гипоксические расстройства, активация реакций ПОЛ, при этом основная роль здесь отводится ксантиноксидазе, с одновременной депрессией антиоксидантной системы, токсическому воздействию бактериальных токсинов и лизосомальных ферментов нейтрофилов, нарушение системы местного иммунитета кишечной стенки.
3. Аллопуринол, как ингибитор ксантиноксидазы способен снижать интенсивность бактериальной транслокации.
4. Чаще процессу транслокации подвергались микроорганизмы из семейства Enterobacteriaceae.
5. Бактериальная транслокация при острой непроходимости кишечника является главным индуктором системного распространения инфекта, развития синдрома системного воспалительного ответа, абдоминального сепсиса, полиорганной дисфункции.
Апробация диссертации: состоялась на кафедре общей хирургии ММА им. на базе ГКБ № 23 им. «Медсантруд». Материалы исследования были представлены на медицинском факультете СурГУ в 2005, на Всероссийском научном форуме «Хирургия 2005» и на научно-практической конференции в г. Твери (декабрь 2006). По теме диссертации опубликовано 8 научных работ.
Объём и структура работы: Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы. Работа изложена на 162 страницах машинописного текста, иллюстрирована 44 рисунками, содержит 18 таблиц. Библиография включает 254 источника, из них 146 отечественных и 108 иностранных.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
Для выполнения поставленных задач было проведено восемь серий экспериментов на 92 половозрелых кроликах обоего пола весом от 2500 до 4000 гр. Оперативные вмешательства и выведение животных из эксперимента выполнены под наркозом с соблюдением «Правил проведения эксперимента на животных…». Использовали ингаляционный масочный эфирный наркоз.
Всех кроликов мы разделили на три группы. I группа с тонкокишечной непроходимостью (n=36), II группа – с толстокишечной (n=36). Каждая из этих двух групп была подразделена на 3 подгруппы – A, B, C, численностью 10 животных в подгруппе A, 12 животных в подгруппе B и 14 – в подгруппе C. В подгруппу А входили животные с 24 ч непроходимостью, в подгруппу B – с 48 ч ОНК, в подгруппу C – с 72 ч острой механической непроходимостью кишечника. В III контрольной группе животных – D (n=10) моделирование обтурационной непроходимости кишечника не выполнялось.
После обработки операционного поля с соблюдением правил асептики животным выполнялась срединная лапаротомия. В I группе кроликов строго у брыжеечного края подвздошной кишки без вовлечения в патологический процесс брыжейки проводили лигатуру, накладывали кисетный шов, который затягивали до создания обтурации. Во II группе животных таким же образом моделировалась толстокишечная обтурационная непроходимость в дистальном отделе толстой кишки. Брюшная стенка послойно ушивалась наглухо. Релапаротомии выполнялись через 24 ч в подгруппах А, через 48 ч в подгруппах В, через 72 ч – в подгруппах С. Кроме того, мы создали подгруппу (восьмую) животных – Allo (n=10). Кроликам в этой подгруппе в течение 3 сут до проведения эксперимента мы давали аллопуринол per os из расчёта 50 мг/кг в сут. После этого приступали к моделированию 72-х часовой тонкокишечной непроходимости по отработанной схеме. Срок обтурации нами выбран из-за наибольшей степени патобиохимических и гистологических изменений в кишечной стенке. Тонкая кишка нами была выбрана из-за высокой концентрации ксантиноксидазы в слизистой последней.
1. Для исследования внутрикишечной гипертензии и интрамуральной гемоциркуляции кишечной стенки мы использовали устройство для измерения внутрикишечного давления (ВКД), разработанное [1996], принцип работы которого основан на изменении освещённости фоторезистора при нарастании внешнего избыточного давления, что регистрируется контрольно-измерительным прибором, шкала которого проградуирована в мм рт. ст. Интрамуральное артериальное и венозное давление измеряли по модифицированному методу [1980]. Регистрировали максимальное артериальное давление при появлении пульсирующей струи крови в контурированном сосуде. Минимальное артериальное давление фиксировалось, когда просвет артериального сосуда полностью восстанавливался. Интрамуральное венозное давление регистрировалось после того, как заполнялась соответствующая вена. Ангиоархитектонику желудочно-кишечного тракта изучали методом прижизненной трансиллюминационной ангиоскопии.
2. Для определения реакций свободного радикального окисления в слизистой оболочке тонкой и толстой кишки исследовали уровень диеновых конъюгат, малонового диальдегида и активность ксантиноксидазы. Состояние антиоксидантной системы (АОС) оценивали на основании активности ферментов супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы. Прижизненный забор слизистой оболочки тонкой и толстой кишки осуществлялся во время релапаротомии. Ткани исследовали методом электронно-парамагнитного резонанса на радиоспектрометре «Радиометр R – 1307» (Россия). ПОЛ определялось путём измерения активного вещества тиобарбитуровой кислоты в наномолях с малональдегидом в качестве стандарта. Активность измерялась в наномолях на 1 гр ткани. Для промежуточных продуктов липопероксидации активность измерялась в наномолях на мг в минуту. Активность ксантиноксидазы определяли адаптированным методом Parks [Parks D. A. 1986]. Активность каталазы определяли по методу Aebi [Aebi H., 1984]. Активность фермента СОД измеряли по методу McCord et Fridovich [McCord J. M., Fridovich I., 1969]
3. Для проведения морфологических, морфометрических и гистобактериоскопических исследований фрагменты стенки кишки, МЛУ, внутренних органов фиксировали в 10% нейтральном растворе формалина. После обезвоживания в спиртах восходящей концентрации материал заливали в парафин по общепринятой схеме. Парафиновые срезы толщиной 5-7 мкм окрашивали гематоксилином и эозином для морфологического и морфометрического исследования и по Романовскому-Гимзе для бактериоскопического исследования.
4. Для исследования транслокации в экстраинтестинальные органы фрагменты МЛУ, печени, лёгких и селезёнки гомогенизировали, полученную взвесь сеяли на чашки Петри. Любой рост культур принимали за бактериальную транслокацию. В дальнейшем выделяли чистые культуры и проводили их видовую идентификацию по Берджи [1997]. Исследуемый материал смотрели под микроскопом в мазках, окрашенных по Граму и в нативных препаратах для изучения морфологии микроорганизмов. Культивирование портальной и системной крови проводили на жидких обогащённых питательных средах для прямого посева крови, полужидкой среде Тароцци для выявления анаэробной флоры, средах Haemoline Performance фирмы bioMеrieux (Франция). При появлении роста на гемосредах, делали мазки, окрашивали их по Граму и производили высевы на соответствующие селективные питательные среды с последующей идентификацией. Во время релапаротомии производили посев перитонеального экссудата. Для транспортировки материала использовали стерильные герметичные флаконы с транспортной средой Amies. Далее засеивали материал на чашки Петри с 5% кровяным агаром и при наличии роста культур производили морфологическую и тинкториальную идентификацию в мазках, окрашенных по Граму. После микроскопического исследования сеяли материал на плотные селективные питательные среды. Для выращивания аэробных микроорганизмов чашки помещали в термостат при температуре 37 С на 24–72 часа. Культивирование анаэробных микроорганизмов производили в анаэростатах, в которые предварительно помещали газогенераторные пакеты с катализатором BioMerieux (Франция).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
1). Влияние внутрикишечной гипертензии на интрамуральную гемоциркуляцию при острой непроходимости кишечника.
Результаты внутриполостной тонометрии и трансиллюминационной ангиотензометрии показали, что в группе животных с тонкокишечной непроходимостью в подгруппе А максимальное интрамуральное артериальное давление равняется 68.5+3.6 мм рт. ст., минимальное артериальное давление – 39.0+2.8 мм рт. ст., а интрамуральное венозное давление было на уровне 22.4+2.2 мм рт. ст. (р<0.05). При этом, внутрикишечное давление равнялось 9.6+0.3 мм рт. ст. У животных в подгруппе В максимальное интрамуральное артериальное давление (далее – max. ИАД) было 57.0+3.1 мм рт. ст., минимальное интрамуральное артериальное давление (далее – min. ИАД) составляло 28.1+2.3 мм рт. ст., интрамуральное венозное давление (ИВД) – 25.3+1.8 мм рт. ст. (р<0.03). При этом, внутрикишечное давление (ВКД) равнялось 13.7+0.6 мм рт. ст. При 72 ч непроходимости max. ИАД – 42.3+2.5 мм рт. ст., min. ИАД – 21.2+2.0 мм рт. ст., а ИВД составило 29.6+1.9 мм рт. ст. (p<0.05). При этом ВКД было – 18.4+0.8 мм рт. ст. В контрольной группе животных max. ИАД составило 75.0+2.1 мм рт. ст., min. ИАД – 45.0+2.6 мм рт. ст, ИВД – 20.5+1.8 мм рт. ст. (p<0.02).
При толстокишечной непроходимости в подгруппе А max. ИАД составило 54.7+3.4 мм рт. ст., min ИАД – 31.6+3.2 мм рт. ст., ИВД – 17.7+2.1 мм рт. ст (p<0.05). При показателях ВКД – 8.6+0.3 мм рт. ст. В подгруппе В max. ИАД равнялось – 40.8+2.6 мм рт. ст., min. ИАД – 21.6+1.7 мм рт. ст., а ИВД – 20.6+1.4 мм рт. ст. (p<0.01) при значениях ВКД 16.2+0.9 мм рт. ст. В подгруппе С max. ИАД было 30.8+2.5 мм рт. ст., min ИАД – 20.5+2.8 мм рт. ст, а ИВД составило – 23.5+2.2 мм рт. ст. (p<0.03). При этом, внутрикишечная гипертензия достигала значения 26.3+1.0 мм рт. ст.
Показатели максимального интрамурального артериального давления в контрольной группе были на цифрах 60.0+3.2 мм рт. ст., минимального интрамурального артериального давления – 37.5+2.4 мм рт. ст., а интрамурального венозного давления – 16.0+1.8 мм рт. ст. (p<0.05).
Таким образом, результаты внутрикишечной тонометрии демонстрируют рост ВКД при прогрессировании сроков ОНК. По нашим данным, через 72 ч ВКД в тонкой кишке превышает контрольные величины в 13 раз, а в толстой – в 14 раз. Внутрикишечная гипертензия (ВКГ) является инициирующим фактором в развитии деструктивных изменений кишечной стенки, связанных с гипоперфузией органа. По данным ангиотензометрии было выявлено, что при прогрессировании ВКГ и сроков эксперимента соответственно, происходит неуклонное снижение ИАД и рост ИВД.
Возникающие гемодинамические нарушения в обеих группах при постоянно нарастающей ВКГ иллюстрируют проявление циркуляторной гипоксии и ишемии кишечной стенки, что в итоге приводит к нарушению целостности эпителиального барьера.
2). Механизмы реакций окислительного стресса и антиоксидантная система слизистой оболочки тонкой и толстой кишки.
В обеих группах животных происходит активное накопление продуктов ПОЛ в кишечной стенке (табл. 1). При прогрессировании сроков непроходимости возрастала активность ксантиноксидазы, причём при тонкокишечной обтурации активность фермента через 72 ч в слизистой оболочке была выше в 22.5 раз по сравнению с толстокишечной непроходимостью, что может говорить о высоком напряжении процессов пероксидазного катализа в слизистой оболочке тонкой кишки (табл. 2).
Таблица 1. Содержание продуктов ПОЛ в слизистой оболочке тонкой и толстой кишки при непроходимости кишечника.
Подгруппы животных | Время после создания обтурации (в часах) | Тонкокишечная непроходимость | Толстокишечная непроходимость | ||
Малоновый диальдегид нмоль/г ткани (M+m) | Диеновые конъюгаты нмоль/мг мин (M+m) | Малоновый диальдегид нмоль/г ткани (M+m) | Диеновые конъюгаты нмоль/мг мин (M+m) | ||
A | 24 | 26.4 + 1.1 | 18.3 + 1.5 | 12.4 + 1.2 | 4.0 + 0.9 |
B | 48 | 31.7 + 0.9 | 24.2 + 1.4 | 16.2 + 1.5 | 5.9 +1.8 |
C | 72 | 56.8 + 1.7 | 44.6 + 1.2 | 18.1 + 1.7 | 7.9 + 1.3 |
Группа D | контроль | 9.6 + 1.2 | 4.2 + 0.7 | 4.7 + 1.1 | 1.8 + 0.6 |
Таблица 2. Активность ксантиноксидазы в слизистой оболочке тонкой и толстой кишки при острой обтурационной непроходимости.
Подгруппы животных | Время после создания обтурации (в часах) | Активность ксантиноксидазы в тонкой кишке мЕ/г (M+m) | Активность ксантиноксидазы в толстой кишке мЕ/г (M+m) |
A | 24 | 55.6 + 0.9 | 2.4 + 0.4 |
B | 48 | 79.2 + 3.1 | 3.1 + 0.3 |
C | 72 | 121.7 + 4.6 | 5.4 + 0.2 |
Группа D | контроль | 23.9 + 0.4 | 1.7 + 0.2 |
Интересная закономерность прослеживается при анализе системы антиоксидантной защиты в слизистой оболочке тонкой и толстой кишки. В подгруппах А через 24 ч имеется достоверное увеличение показателей каталазы и СОД по сравнению с контрольной группой, что указывает на компенсаторную функцию антиоксидантной системы и адекватность антиоксидантных адаптационных реакций, при прогрессировании сроков эксперимента до 48 и особенно 72 ч происходит неуклонное снижение показателей ферментов АОС, что говорит о несостоятельности антиоксидантной защиты клеток и необратимости ишемического повреждения клеток продуктами ПОЛ (табл. 3).
Таблица 3. Антиоксидантная система при кишечной непроходимости.
Подгруппы животных | Время после создания обтурации (в часах) | Тонкокишечная непроходимость | Толстокишечная непроходимость | ||
Каталаза мЕ/г (M+m) | СОД мЕ/г (M+m) | Каталаза мЕ/г (M+m) | СОД мЕ/г (M+m) | ||
A | 24 | 19.6 + 0.4 | 57.5 +1.1 | 12.3 + 0.7 | 28.7 + 1.2 |
B | 48 | 14.8 + 0.4 | 30.9 + 0.9 | 8.4 + 0.6 | 16.3 + 1.1 |
C | 72 | 4.3 + 0.2 | 11.7 + 0.6 | 2.1 + 0.2 | 4.5 + 0.3 |
Группа D | контроль | 13.2 + 0.6 | 34.8 + 1.2 | 7.6 + 0.5 | 16.9 + 0.4 |
Заметно отличается активность КСО в подгруппе Allo. Оказалось, что активность ксантиноксидазы в слизистой оболочке у животных, получавших аллопуринол в пред - и послеоперационном периоде снижается на 56.9% по сравнению с подгруппой животных, не получавших аллопуринол что в количественном соотношении составило 52.4+2.6 мЕ/г и 121.7+4.6 мЕ/г (p<0.05). Содержание МДА и ДК в подгруппе Allo также достоверно снижалось на 44.7% и 61.2% соответственно по сравнению с подгруппой С (p<0.02).
Итак, полученные результаты свидетельствуют о выраженных изменениях в системе ПОЛ–АОС. В динамике патологического процесса возрастает активность реакций ПОЛ, КСО в кишечной стенке, с одновременной депрессией АОС, что характеризует ишемическое повреждение кишечной стенки продуктами пероксидации и обуславливает нарушение целостности кишечного барьера. Антиоксидантные ферменты через 24 ч от начала эксперимента достоверно превышают контрольные величины, что может говорить о мобилизации антиоксидантной, цитопротективной системы в ответ на ишемическое повреждение, однако уже через 48 ч эти компенсаторные реакции нивелируются, прогрессивно снижаясь к 72 ч. При ингибировании КСО с помощью аллопуринола можно добиться снижения активности реакций ПОЛ и стабилизации барьерной функции слизистой оболочки.
3). Морфологические исследования кишечной стенки и внутренних органов при острой непроходимости кишечника.
При гистологическом исследовании стенки тонкой кишки через 24, 48 и 72 ч обнаружена картина острого энтерита. При исследовании через 72 ч обнаружены резкие некротические изменения слизистой оболочки (СО). При прогрессировании патологического процесса было выявлено уменьшение высоты ворсинок и глубины крипт. Увеличивается степень инфильтрации собственной пластинки и межкриптального пространства нейтрофилами. В составе СО снижается количество межэпителиальных лимфоцитов, зрелых и незрелых плазмоцитов, макрофагов.
При гистологическом исследовании стенки толстой кишки через 24, 48 и 72 ч у всех животных обнаружена картина острого колита. Некротические изменения поверхностного отдела СО у животных возникли через 72 часа. При увеличении сроков непроходимости снижается глубина крипт, количество бокаловидных клеток, число митозов на крипту. Увеличивается клеточная плотность инфильтрата, число лимфоцитов в поверхностном эпителии крипт, возрастает количество зрелых и незрелых плазмоцитов, макрофагов.
При гистологическом исследовании МЛУ выявлена повышенная реакция лимфоцитов и плазмоцитов в лимфоидных фолликулах, отёк стромы мозгового вещества и уменьшение ширины корковой части. При увеличении сроков обтурации обнаруживается резкая септическая реакция, стаз в сосудах МЦР, редукция клеточных элементов лимфоидной ткани.
В печени была выявлена гидропическая дистрофия гепатоцитов с перипортальной гистиолимфоцитарной инфильтрацией. Значительная реакция купферовских клеток. При прогрессировании непроходимости выявляется тотальная баллонная дистрофия гепатоцитов с очагами фокального колликвационного некроза и перифокальной инфильтрацией нейтрофилами и лимфоцитами. Купферовские клетки с резкой реакцией и гипертрофией ядер.
В ткани лёгких в интерстиции отдельные очаги пневмонии и периваскулярная инфильтрация лимфоцитами. На более поздних сроках – множественные кровоизлияния и сливные множественные очаги интерстициальной пневмонии. Вокруг сосудов в межальвеолярных перегородках – скопления нейтрофилов.
Таким образом, данные морфологических и морфометрических исследований кишечной стенки и внутренних органов демонстрируют сначала компенсаторные, а затем и необратимые изменения кишечного барьера, грубые структурные нарушения, происходящие в МЛУ, печени и лёгких. Помимо морфологических изменений в кишечной стенке и внутренних органах, возникающие иммунные нарушения эпителиального кишечного барьера, МЛУ, печени приводят к транслокации эндогенной микрофлоры в экстраинтестинальные органы и через стенку кишки.
4). Результаты исследования видового и количественного состава микрофлоры при бактериальной транслокации во внутренние органы, кровь и перитонеальный экссудат.
а). Мезентериальные лимфатические узлы: При тонкокишечной обтурации в подгруппе А инфицированность МЛУ составила 60%. При увеличении сроков обтурации до 48 и 72 ч бактериальная транслокация в МЛУ наблюдалась у всех животных и достигала 100%. При толстокишечной непроходимости в подгруппе А бактериальная транслокация в МЛУ наблюдалась в 44.4%, в подгруппе B – в 55.6%, а при прогрессировании моделируемой патологии до 3 суток транслокация в МЛУ была обнаружена у всех животных, что составило 100%.
б). Печень: У кроликов с 24 ч тонкокишечной непроходимостью транслокация бактерий в печень была обнаружена в 40%. При увеличении срока эксперимента до 2 сут инфицированность паренхимы печени была отмечена уже у 70% животных, а при 72 часовой непроходимости – в 90% случаев. У кроликов II группы в подгруппе А транслокация в печень составила 22.2%, у животных подгруппы В бактериальная транслокация выявлена уже в 55.6% наблюдений, а при увеличении обтурации до 72 ч (подгруппа С) микроорганизмы культивировались из печени у всех животных – в 100%.
в). Лёгкие: Ни одного случая роста культур бактерий мы не обнаружили в подгруппах А. У кроликов с 48 ч тонкокишечной обтурацией бактериальная транслокация в лёгкие была обнаружена только в 20%. При увеличении сроков непроходимости до трёх суток количество животных с положительным ростом бактериальных культур возрастало до 30%. Во второй группе животных только у двух из девяти особей в подгруппе В выявлена бактериальная транслокация в лёгкие, что составило 22.2%. При прогрессировании обтурации до 3-х суток частота транслокации микрофлоры в лёгкие возрастает в два раза и составляет уже 40%.
г). Селезёнка: В подгруппах A бактериального роста из ткани нами не было получено. В первой группе при прогрессировании сроков эксперимента были получены положительные культуры ткани селезёнки в 30% случаев при двух и трёх суточной обтурации. Характер и частота БТ в селезёнку по сравнению с транслокацией в лёгкие не претерпевают существенных изменений при толстокишечной непроходимости. При 48 ч непроходимости транслокация микрофлоры выявлена в 22.2%, а при 72 ч – у 40% кроликов.
Видовой состав микрофлоры представлен в табл. 4,5.
д). Портальная кровь: У животных первой группы в подгруппе А портальная бактериемия была обнаружена у 4 животных (40%), в подгруппе B – у 7 животных (70%), в подгруппе C микроорганизмы были обнаружены в портальном русле уже у всех 10 животных, что составило 100%. При толстокишечной непроходимости в подгруппе А бактерии выделены из крови у 2 животных (22.2%), в подгруппе В уже у 4 (44.4%), а в подгруппе С портальная бактериемия определялась у 10 животных, что составило 100%. В отличие от сравниваемой подгруппы С, где бактериемия была выявлена в 100% случаев, у животных подгруппы Allo, бактерии в портальной крови были обнаружены только в 44.4%
е). Системная кровь: В подгруппах А во всех случаях системная кровь была стерильной, а в подгруппах В и С бактерии в системном кровотоке были выявлены в 20% в каждой подгруппе при тонкокишечной обтурации. Во второй группе животных при увеличении сроков обтурации до двух суток инфицированность артериальной крови была выявлена в 22.2%, а при трёх суточной непроходимости эта цифра увеличивается вдвое – бактериемия выявлена уже у 4 животных, что составило 40%. В подгруппе Allo мы также не получили роста бактерий в системной крови ни в одном случае.
ж). Перитонеальный экссудат: Через 24 ч от создания тонкокишечной обтурации положительный рост был получен в 30%, через 48 ч инфицированность экссудата определяется уже у 50% животных, а в подгруппе С – в 90% наблюдений. При 24 ч толстокишечной непроходимости инфицирование брюшной полости выявлено в 22.2% наблюдений. При увеличении сроков эксперимента до двух суток микроорганизмы обнаруживались в перитонеальном экссудате в 44.4%, а в подгруппе С – у всех десяти кроликов (100%). В подгруппе животных, получавших аллопуринол (Allo), микроорганизмы обнаружены в перитонеальном экссудате в 55.6%, что почти в два раза меньше по сравнению с подгруппой С.
Видовой состав микрофлоры представлен в табл. 6,7.
У животных подгруппы С, не получавших аллопуринол, инфицированность МЛУ была в 100% случаев, а печени – в 90%, у животных же подгруппы Allo, которые получали аллопуринол, бактериальная транслокация в МЛУ была обнаружена только в 55.6%, печень – 33.3%.
Таблица 4. Бактериальная транслокация при тонкокишечной обтурации во всех подгруппах с учётом ассоциации микроорганизмов в колониях.
Микроорганизмы | Тонкокишечная обтурация n (%) | |||
МЛУ | Печень | Лёгкие | Селезёнка | |
Escherichia coli | 17 (65.4) | 14 (70) | 3 (60) | 3 (50) |
Klebsiella spp. | 4 (15.4) | 3 (15) | 1 (20) | 2 (33.3) |
Proteus mirabilis | 3 (11.5) | 3 (15) | 0 (0) | 0 (0) |
Enterobacter cloacae | 2 (7.7) | 1 (5) | 0 (0) | 0 (0) |
Citrobacter spp. | 2 (7.7) | 2 (10) | 0 (0) | 0 (0) |
Enterococcus faecalis | 5 (19.2) | 4 (20) | 1 (20) | 1 (16.7) |
Bacteroides fragilis | 6 (23.1) | 4 (20) | 1 (20) | 1 (16.7) |
Clostridium perf. | 1 (3.9) | 0 (0) | 0 (0) | 0 (0) |
Staphylococcus aureus | 3 (11.5) | 2 (10) | 0 (0) | 0 (0) |
Pseudomonas aeruginosa | 3 (11.5) | 2 (10) | 0 (0) | 1 (16.7) |
Таблица 5. Бактериальная транслокация при толстокишечной обтурации во всех подгруппах с учётом ассоциации микроорганизмов в колониях.
Микроорганизмы | Толстокишечная обтурация n (%) | |||
МЛУ | Печень | Лёгкие | Селезёнка | |
Escherichia coli | 13 (68.4) | 10 (58.9) | 3 (50) | 3 (50) |
Klebsiella spp. | 3 (15.8) | 2 (11.8) | 1 (16.7) | 1 (33.3) |
Proteus mirabilis | 3 (15.8) | 2 (11.8) | 0 (0) | 0 (0) |
Enterobacter cloacae | 3 (15.8) | 2 (11.8) | 0 (0) | 0 (0) |
Citrobacter spp. | 1 (5.3) | 0 (0) | 0 (0) | 0 (0) |
Enterococcus faecalis | 4 (21.1) | 4 (23.5) | 0 (0) | 1 (16.7) |
Bacteroides fragilis | 7 (36.9) | 6 (35.3) | 2 (33.3) | 2 (33.3) |
Clostridium perf. | 2 (10.5) | 1 (5.9) | 0 (0) | 0 (0) |
Staphylococcus aureus | 2 (10.5) | 3 (17.7) | 0 (0) | 0 (0) |
Pseudomonas aeruginosa | 4 (21.1) | 4 (23.5) | 1 (16.7) | 1 (16.7) |
Бактериального роста культур из лёгких и селезёнки в подгруппе Allo не было обнаружено ни в одном случае. Напротив, у животных подгруппы С транслокация в лёгкие и селезёнку была в 30%.
Таблица 6. Бактериальная транслокация в кровь и перитонеальный экссудат при тонкокишечной обтурации во всех подгруппах животных.
Микроорганизмы | Тонкокишечная обтурация n (%) | ||
Портальная кровь | Системная кровь | Перитонеальный экссудат | |
Escherichia coli | 8 (38.1) | 2 (50) | 4 (23.5) |
Klebsiella spp. | 2 (9.5) | 0 (0) | 2 (11.8) |
Proteus mirabilis | 3 (14.3) | 0 (0) | 1 (5.9) |
Enterobacter cloacae | 2 (9.5) | 0 (0) | 1 (5.9) |
Citrobacter spp. | 1 (4.8) | 0 (0) | 1 (5.9) |
Enterococcus faecalis | 3 (14.3) | 1 (25) | 2 (11.8) |
Bacteroides fragilis | 5 (23.8) | 1 (25) | 4 (23.5) |
Clostridium perf. | 1 (4.8) | 0 (0) | 1 (5.9) |
Staphylococcus aureus | 2 (9.5) | 0 (0) | 1 (5.9) |
Pseudomonas aeruginosa | 3 (14.3) | 1 (25) | 3 (17.7) |
Таблица 7. Бактериальная транслокация в кровь и перитонеальный экссудат при толстокишечной обтурации во всех подгруппах животных.
Микроорганизмы | Толстокишечная обтурация n (%) | ||
Портальная кровь | Системная кровь | Перитонеальный экссудат | |
Escherichia coli | 5 (31.3) | 3 (50) | 4 (25) |
Klebsiella spp. | 1 (6.3) | 1 (16.7) | 1 (6.3) |
Proteus mirabilis | 2 (12.5) | 0 (0) | 1 (6.3) |
Enterobacter cloacae | 1 (6.3) | 0 (0) | 0 (0) |
Citrobacter spp. | 1 (6.3) | 0 (0) | 0 (0) |
Enterococcus faecalis | 2 (12.5) | 2 (33.3) | 3 (18.8) |
Bacteroides fragilis | 4 (25) | 2 (33.3) | 5 (31.3) |
Clostridium perf. | 1 (6.3) | 0 (0) | 1 (6.3) |
Staphylococcus aureus | 2 (12.5) | 0 (0) | 2 (12.5) |
Pseudomonas aeruginosa | 2 (12.5) | 1 (16.7) | 2 (12.5) |
Итак, в обеих группах животных была выявлена бактериальная транслокация в органы, кровь и перитонеальный экссудат, причём с увеличением сроков непроходимости расширяется видовой и количественный состав высеваемой микрофлоры. Среди микроорганизмов наиболее часто высеивалась кишечная палочка. В контрольной группе транслокации микроорганизмов не отмечено.
Аллопуринол, ингибируя активность КСО, согласно нашим результатам, способен снижать интенсивность бактериальной транслокации.
ВЫВОДЫ
1. Прогрессирующая внутрикишечная гипертензия является пусковым фактором, вызывающим ухудшение интрамуральной перфузии и микроциркуляции. Через 72 ч ишемические изменения слизистой и нарушение микроциркуляции в стенке тонкой кишки регистрируются при более низких цифрах ВКД – 18.4+0.8 мм рт. ст., чем в стенке толстой – 26.3+1.0 мм рт. ст.
2. При тонкокишечной непроходимости ВКД через 24, 48 и 72 ч увеличивается соответственно в 6.9, 9.8 и 13.1 раз, что приводит к снижению максимального ИАД на 8.7%, 24% и 43.6%, характеризующего циркуляторную ишемию и увеличению ИВД, свидетельствующего о нарушении венозного оттока на 9.3%, 23.4% и 44.4% соответственно по сравнению с контролем. При обтурации толстой кишки давление в ней через 24, 48 и 72 ч увеличивается соответственно в 4.5, 8.5 и 13.8 раз, со снижением максимального ИАД на 8.8%, 32% и 48.7% и увеличением ИВД на 10.6%, 30.6% и 46.9%.
3. В патогенезе ишемического повреждения кишечной стенки важное значение имеет активация процессов перекисного окисления липидов и снижение активности антиоксидантной системы. Одним из основных генераторов ПОЛ в стенке тонкой кишки является ксантиноксидаза, значение которой через 24, 48 и 72 ч увеличивается на 133%, 231% и 409% соответственно. Активность последней в тонкой кишке в 22.5 раз выше, чем в толстой, что приводит к более ранним и выраженным ишемическим повреждениям тканей. После компенсаторного увеличения активности основных ферментов антиоксидантной системы через 24 ч, происходит прогрессирующее снижение их активности через 48 и 72 ч.
4. Аллопуринол приводит к снижению активности ксантиноксидазы в тонкой кишке через 72 ч на 56.9%, что способствует стабилизации барьерной функции слизистой оболочки и снижению бактериальной транслокации в мезентериальные лимфатические узлы на 44.4%, печень – 56.7%, портальную кровь и перитонеальный экссудат на 55.6% и 34.4% соответственно.
5. Основной причиной бактериальной транслокации является нарушение целостности эпителиального кишечного барьера, которое развивается уже через 24 ч, с инфицированием мезентериальных лимфатических узлов, портальной крови и печени в обеих группах животных. С увеличением сроков непроходимости до 72 ч расширяется видовой и количественный состав микроорганизмов в качестве микробных ассоциаций, при этом необратимые морфологические изменения слизистой оболочки кишки приводят к поступлению бактерий в кишечную стенку, перитонеальный экссудат, кровеносное и лимфатическое русло, внутренние органы. Наиболее часто культивировались микроорганизмы семейства Enterobacteriaceae. При толстокишечной непроходимости частота транслокации облигатных анаэробов выше, чем при тонкокишечной обтурации.
6. Процессу транслокации микрофлоры способствует прогрессирующий дефицит и несостоятельность гуморального и клеточного местного иммунитета тонкой кишки, мезентериальных лимфатических узлов и ретикулоэндотелиальной системы печени. При тонкокишечной обтурации происходит постепенное снижение количества незрелых и зрелых плазмоцитов, макрофагов. Напротив, при толстокишечной непроходимости наблюдается увеличение активности клеток местной иммунной системы. Несостоятельность барьерной функции звёздчатых ретикулоэндотелиоцитов печени может знаменовать собой переход воспалительного процесса на системный уровень, развитие синдрома системного воспалительного ответа и абдоминального сепсиса.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1. Учитывая, что нарушение целостности эпителиального барьера и развитие бактериальной транслокации через кишечную стенку наступают через 24 ч, сроки операции, направленной на устранение непроходимости кишечника, декомпрессию кишки с использованием современных методов детоксикации и деконтаминации в этот период времени являются наиболее оптимальными.
2. В комплексное лечение острой непроходимости кишечника необходимо включить современную иммуннокорригирующую терапию, гепатотропные препараты для мобилизации барьерной функции печени.
3. Аллопуринол – ингибитор ксантиноксидазы, обладающий антиоксидантным, антигипоксическим и цитопротективным действием, может быть рекомендован для стабилизации целостности эпителиального барьера и уменьшения бактериальной транслокации.
СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:
1). , , Дарвин внутрикишечной гипертензии при острой обтурационной непроходимости кишечника в эксперименте. // СурГУ Ханты-Мансийского авт. Округа // Сб. науч. трудов № 22. – 2005. – С. 112-118.
2). , , Сотников внутрикишечной гипертензии на интрамуральную гемоциркуляцию при острой обтурационной кишечной непроходимости. // Материалы Всероссийского научного форума «Хирургия 2005». – С. 14-16.
3). , Афанасьев реакции и антиоксидантная система слизистой оболочки при острой обтурационной непроходимости кишечника. // Материалы Всероссийского научного форума «Хирургия 2005». – С. 86-88.
4). , , Сотников транслокация в условиях острой непроходимости кишечника. // Вестник РАМН. – 2006. – № 9-10. – С. 34-38.
5). , , Сотников окислительного стресса и антиоксидантная система в слизистой оболочке при механических формах непроходимости кишечника. // Материалы научно-практической конференции врачей России. – Тверь. – 2006. – С. 303-304.
6). , , Сотников транслокация при острой обтурационной непроходимости кишечника. Некоторые патофизиологические аспекты. // Материалы научно-практической конференции, посвящённой 140-летию ГКБ № 23 им. «Медсантруд». – М. – 2006. – С. 175-176.
7). , , Сотников и количественный состав микрофлоры в экстраинтестинальных органах, крови и перитонеальном экссудате при механических формах непроходимости кишечника. // Материалы научно-практической конференции, посвящённой 140-летию ГКБ № 23 им. «Медсантруд». – М. – 2006. – С. 177-178.
8). , , Сотников системы местного иммунитета при механических формах непроходимости кишечника. // Материалы научно-практической конференции, посвящённой 140-летию ГКБ № 23 им. «Медсантруд». – М. – 2006. – С. 179-180.
