. Метаболизм скелетных мышц и возможности его регуляции при травмах и удлинении конечности методом Илизарова (стр. 1 )

На правах рукописи

Метаболизм скелетных мышц и возможности его регуляции при травмах и удлинении конечности методом илизарова

03.00.04 – биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Нижний Новгород – 2009

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Российский научный центр «Восстановительная травматология и ортопедия» имени академика » Росмедтехнологий.

Научный консультант: доктор биологических наук

Официальные оппоненты:

– доктор биологических наук, профессор

– доктор медицинских наук

– доктор медицинских наук, профессор

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия», г. Челябинск

Защита диссертации состоится « 15 » октября 2009 года на заседании диссертационного совета Д 212.166.15 при Нижегородском государственном университете им. ( г. Нижний Новгород, пр. Гагарина, корп. 1, ауд. ).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Нижегородского государственного университета им.

Автореферат разослан « » 20__ г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук,

доцент

Общая характеристика работы

Актуальность исследования. Известно, что скелетные мышцы играют ключевую роль в создании оптимальных биомеханических условий, нормальной трофики и функции травмированной и удлиняемой конечности ( и др., 1996). При этом репаративные возможности мышечной ткани отличаются от возможности к репаративному восстановлению костной ткани, в связи с чем, зачастую, именно функциональное состояние скелетных мышц является лимитирующим фактором при лечении и реабилитации больных ортопедотравматологического профиля ( и др., 1998; 2003; 2007).

Функциональные возможности скелетных мышц зависят от их структурно-метаболического профиля, определяемого качественным и количественным составом сократительных белков, а также особенностями тканевого обмена, и, прежде всего, типом энергообеспечения ( и др., 2005; A. Sargeant, 2007.). Несмотря на то, что метаболические процессы в скелетных мышцах находятся под жестким контролем системных, локальных и генетических факторов, мышцы демонстрируют значительную пластичность и лабильность структурно-метаболического профиля в ответ на изменения их функциональной нагрузки (S. E. Dunn et al., 1997; D. Pette, 2002; A. M. Niess et al., 2007.). Материальной основой этому является значительный генетический полиморфизм как сократительных, так и регуляторных белков и ферментов, а также высокая взаимозаменяемость путей энергетического обмена (D. Pette et al., 2001.). В связи с этим восстановление функциональной активности мышц в посттравматический и реабилитационный период зависит от интенсивности восстановления ее структурно-метаболических характеристик и должно обеспечиваться достаточным количеством пластических и энергетических ресурсов в ткани.

Если многочисленные данные физиологических, морфологических и гистохимических исследований дают достаточное представление о функциональных и структурных изменениях в скелетных мышцах при ее репаративной регенерации при скелетных травмах и в условиях оперативного удлинения ( и др., 2003; , 2003; и др., 2004; и др., 2004; и др., 2008; и др., 2008; C. A. Lindsey et al., 2002; T. Tsujimura et al., 2006.), то результатов биохимических исследований, позволяющих объективно оценить состояние метаболизма скелетных мышц, явно недостаточно. Особенно это касается исследований при оперативном удлинении конечностей. Практически не изучены также и изменения метаболизма в конечности контралатеральной травмированной или оперированной, хотя функциональная нагрузка на нее в посттравматический и в послеоперационный период значительно возрастает. Кроме того, недостаточно разработаны критерии оценки и схемы лабораторной диагностики и мониторинга за состоянием скелетных мышц у пациентов ортопедотравматологического профиля.

Поиск и разработка эффективных средств для коррекции метаболических нарушений в скелетных мышцах имеет несомненную актуальность, что подтверждают многочисленные клинико-экспериментальные исследования ( и др., 2001; и др., 2006; F. G. Hamel et al., 2003; R. B. Kreider, 2003; L. Boldrin et al., 2007; S. Grefte et al., 2007.). Однако, имеющийся недостаток фактического материала по биохимии мышц при ее регенерации не позволяет сделать вывод о целесообразности проведения коррекции метаболических изменений и необходимости создания специальных препаратов, направленных на восстановление скелетных мышц при лечении патологии опорно-двигательного аппарата. В практике травматологии и ортопедии эффективность таких разрабатываемых средств, на наш взгляд, должна быть основана на возможности одновременного влияния на репарацию костной и мышечной ткани, что должно обеспечивать синхронное восстановление целостности кости и функциональной активности скелетных мышц, составляющих единый анатомо-функциональный блок. В этом плане наиболее доступными и эффективными являются методы пищевой и фармакологической регуляции. Кроме того, эти способы наиболее перспективны в плане их дальнейшего внедрения с использованием наноматериалов и нанотехнологий.

Цель исследования. Сформировать системное представление о метаболизме скелетных мышц и оценить возможности его регуляции при скелетной травме и оперативном удлинении конечности в эксперименте.

Задачи исследования:

1.  Описать возрастные изменения метаболизма скелетных мышц, характеризующие становление их метаболического профиля.

2.  Изучить метаболизм скелетных мышц в условиях оперативного удлинения костей голени по методу Илизарова.

3.  Разработать концепцию поведения скелетных мышц при удлинении конечности по Илизарову.

4.  Выявить особенности обмена мышц при скелетных травмах в эксперименте.

5.  Провести сравнительный анализ биохимических изменений в скелетных мышцах при удлинении конечности и после скелетной травмы.

6.  Выявить нарушения отдельных путей метаболизма, происходящие в скелетных мышцах в посттравматический период и при удлинении костей голени, и разработать критерии для их коррекции.

7.  Предложить способы коррекции метаболизма мышечной ткани в экспериментальных условиях, моделирующих скелетную травму.

8.  Предложить наиболее доступные и информативные лабораторные тесты, характеризующие функциональное состояние скелетных мышц, пригодные для использования их в лабораторном мониторинге у пациентов ортопедотравматологического профиля.

Основные положения, выносимые на защиту:

1.  При удлинении конечности в скелетных мышцах удлиняемого сегмента происходит активация энергетических путей обмена (в том числе и «резервных»), межорганных циклов (Кори и аланиновый), реакций перекисного окисления, что приводит к снижению уровня белка в ткани и изменению кинетических характеристик сократительных белков. Подобные биохимические сдвиги, но только более низкой интенсивности, происходят и в мышцах контралатеральной конечности. Отмеченные изменения носят обратимый характер, восстановление метаболического профиля начинается с момента снятия дистракционных нагрузок.

2.  Метаболические изменения в мышцах после скелетной травмы сопровождаются высокой интенсивностью белкового обмена, реакций перекисного окисления и антиоксидантного звена на фоне компенсированных энергетических затрат. Восстановление энергетического метаболизма скелетных мышц при ранних сроках снятия аппарата происходит в течение трех месяцев после лечения.

3.  Введение низкомолекулярных белковых факторов в область перелома не только стимулирует процессы репаративной регенерации кости, но и вызывает анаболический эффект в скелетных мышцах, способствуя накоплению гликогена и белка в ткани за счет пролонгированного антипротеолитического эффекта. Пероральное применение смеси аминокислот предупреждает потери креатина и креатинфосфата в скелетных мышцах и является фактором, регулирующим межорганный обмен энергетических субстратов.

4.  Определение активности креатинкиназы в сыворотке крови является диагностически ценным и доступным критерием оценки поражения скелетных мышц при травмах и оперативном удлинении конечности.

Научная новизна. Впервые комплексно изучены изменения процессов энергетического, белкового обмена в скелетных мышцах при оперативном удлинении костей голени по Илизарову. Впервые изучено состояние системы перекисного окисления и антиоксидантной защиты в мышцах удлиняемого сегмента. Разработана концепция поведения скелетных мышц в ответ на удлинение конечности. Обнаружено явление активации межорганных обменных путей в ходе оперативного удлинения. Обнаружен феномен снижения количества фракций саркоплазматических белков в скелетных мышцах удлиняемой конечности. Впервые изучены кинетические характеристики миозина, выделенного из скелетных мышц подверженных удлинению. Обнаружен эффект активации «резервных» метаболических путей в мышцах в ответ на возрастающие дистракционные нагрузки. Продемонстрирована высокая лабильность обменных процессов скелетных мышц в ответ на дистракцию и снятие дистракционных нагрузок. Впервые показано, что в мышцах контралатеральной конечности происходят метаболические изменения той же, что и в удлиняемой конечности направленности.

Впервые обнаружено, что метаболические изменения в скелетных мышцах после перелома костей голени в условиях стабильной фиксации аппаратом Илизарова происходят на фоне компенсированных энергетических затрат. Впервые изучены кинетические свойства миозина из скелетных мышц голени после лечения оскольчатого перелома костей голени методом Илизарова. Впервые изучены метаболические особенности в скелетных мышцах голени в зависимости от сроков лечения оскольчатых переломов костей голени. Впервые изучены метаболические изменения, происходящие в скелетных мышцах контралатеральной, не травмированной конечности. Показано, что для процесса регенерации при оперативном удлинении конечности скелетная мышца в основном использует внеклеточные пластические и энергетические источники, при репаративной регенерации в посттравматический период – внутриклеточные.

Впервые продемонстрированы анаболические свойства низкомолекулярных белковых факторов, выделенных из костной ткани, оказываемых на скелетную мышцу при ее посттравматической регенерации. Обнаружена способность смеси аминокислот (лейцин, изолейцин, аргинин и метионин) предупреждать потерю и стимулировать синтез креатина в скелетных мышцах, регулировать межторганный обмен гликогена. Обнаружены гепатотропные свойства данной смеси.

Практическая значимость работы. Полученные данные о существенных изменениях метаболических процессов в мышечной ткани дают обоснования для научного планирования мероприятий по предупреждению нарушений и восстановлению функциональных характеристик скелетных мышц в ходе лечения и в периоде реабилитации пациентов ортопедотравматологического профиля.

Полученные результаты дают теоретическое обоснование для разработки и внедрения фармакологических препаратов и биологически активных добавок на основе аминокислот и белков костной ткани для стимуляции репаративной регенерации костной и мышечной ткани.

Оценена информативность ряда биохимических показателей и предложены наиболее доступные тесты для лабораторной оценки состояния скелетных мышц, что может быть использовано в практической травматологии и ортопедии в качестве дополнительного критерия оценки тяжести скелетной травмы, а также для мониторинга состояния пациентов ортопедотравматологического профиля в период лечения и реабилитации.

Внедрение результатов исследования. По результатам работы в клинико-диагностическую лабораторию центра внедрены методы исследования, характеризующие состояние скелетных мышц при дистракционном остеосинтезе. Материалы работы включены в программу кафедры травматологии и ортопедии ФПК и ППС ГОУ ВПО ТюмГМА, используются в курсе лекций по биохимии для студентов факультета естественных наук Курганского государственного университета. Получены три патента РФ на изобретение.

Апробация работы и публикации. Материалы диссертационного исследования доложены: на научно-практической конференции с международным участием «Новые технологии в медицине» (Курган, 2000); на региональной конференции биохимиков Урала, Поволжья и Западной Сибири «Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии» (Ижевск, 2001); на международной научно-практической конференции «Медицина в XXI веке: эстафета поколений» (Курган, 2001); на IV всероссийской конференции «Актуальные вопросы применения гипербарической оксигенации в хирургии, травматологии и ортопедии» (Курган, 2002); на IV Зауральском фестивале научно-исследовательского, технического и прикладного творчества молодежи «Новые горизонты-2002» (КГСХА, 2002); на VI международном симпозиуме «Биологически активные добавки к пище и проблемы оптимизации питания» (Сочи, 2002); на всероссийской конференции «35 лет гипербарической оксигенации: итоги, проблемы, перспективы» (Москва, 2003); на II Всероссийском симпозиуме «Клинические и фундаментальные аспекты тканевой терапии» (Самара, 2004); на международной научно-практической конференции «Морфофункциональные аспекты регенерации и адаптационной дифференцировки структурных компонентов опорно-двигательного аппарата в условиях механических воздействий» (Курган, 2004); на I и II съездах травматологов и ортопедов Уральского федерального округа (Екатеринбург, 2005; Курган, 2008); на всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые: новые идеи и открытия» (Курган, 2006); на международном конгрессе по наружной фиксации (Каир, 2007); на всероссийской научно-практической конференции «Клеточные и нанотехнологии в биологии и медицине» (Курган, 2007); на юбилейной конференции посвященной 10-летию Южно-Уральского научного центра РАМН (Челябинск, 2008); на V международной конференции АСАМИ (Санкт-Петербург, 2008); на всероссийской научно-практической конференции с

международным участием

«Современные технологии в хирургии позвоночника и периферических нервов» (Курган, 2008); на областном научном обществе ортопедов и травматологов (декабрь 2002; декабрь 2005, апрель 2007, ноябрь 2007). По теме диссертации опубликовано 50 печатных работ, в том числе 2 главы в коллективной монографии. Из печатных работ 12 опубликовано в рецензируемых ВАКом изданиях.

Объем и структура работы. Работа изложена на 233 страницах машинописного текста, состоит из введения, 5 глав, заключения, практических рекомендаций, выводов, списка литературы, 65 таблиц, 57 рисунков, трех схем. Библиографический указатель включает 411 источников: из них 120 – отечественные, 391 – зарубежные. Диссертационное исследование выполнено по плану НИР ФГУ «Российский научный центр «Восстановительная травматология и ортопедия» им. акад.  Росмедтехнологий».

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы

Работа выполнена на базе клинико-экспериментального лабораторного отдела ФГУ «Российского научного центра «Восстановительная травматология и ортопедия» им. акад. Росмедтехнологий». Объектами исследований являлись собаки, крысы и лабораторные мыши, использовался клинический материал. Материалом исследования служили: мышечная ткань, печень, сыворотка крови. В ходе выполнения данной работы применялись биохимические, экспериментальные и статистические методы.

Проведение экспериментальных и клинических исследования разрешено комитетом по этике при ФГУ «РНЦ «ВТО» им. акад. Росмедтехнологий». Содержание животных, оперативные вмешательства и эвтаназию осуществляли в соответствии с требованиями Европейской конвенции по защите экспериментальных животных, в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приложение к приказу Минздрава СССР ) и требованиями инструкции №12/313 Министерства здравоохранения РСФСР «Санитарные правила по устройству, оборудованию и содержанию экспериментальных биологических клиник» от 01.01.2001 г.

Особенности метаболизма скелетных мышц в ходе онтогенеза, при скелетной травме и в условиях оперативного удлинения конечности по методу Илизарова изучали на беспородных собаках, которые были разделены на три серии.

1 серия. На 38 беспородных собаках на разных сроках онтогенеза (от новорожденных, до животных с выраженными старческими изменениями) изучали становление мышечного метаболизма в ходе индивидуального развития.

2 серия. На 43 взрослых беспородных собаках изучали метаболизм скелетных мышц в условиях оперативного удлинения костей голени по Илизарову. У 35 животных режим дистракции составлял 1мм/сутки за 4 приема, у 8 – 3мм/сутки в автоматическом режиме.

3 серия. На 35 взрослых беспородных собаках изучали метаболизм скелетных мышц при моделировании оскольчатого перелома костей голени с последующим лечением аппаратом Илизарова. Объектом исследования во всех сериях служила передняя большеберцовая и икроножная мышца, во 2-й и 3-й сериях – это были мышцы как оперированной, так и контралатеральной конечности. В динамике эксперимента изучали биохимические показатели сыворотки крови.

Эффективность препаратов для регуляции метаболических процессов в скелетных мышцах на различных экспериментальных моделях оценивали на лабораторных крысах-самцах лини Вистар и мышах-самцах линии СВА.

Действие низкомолекулярных белковых факторов, выделенных из костной ткани, изучали на лабораторных интактных мышах линии СВА и крысах. Фармакологические свойства и дозозависимые эффекты при различных способах введения белкового препарата изучали на 92 взрослых интактных мышах-самцах.

Основную часть исследования проводили на крысах, которые были разделены на четыре группы:

1 группа. Интактные животные. 10 здоровых взрослых крыс.

2 группа. «Пилотная» (10 крыс). Изучали изменения системных показателей крови, особенности костной репарации и мышечного метаболизма в условиях моделирования перелома большеберцовой кости для определения оптимальных сроков введения белкового препарата.

3 группа. Контрольная (24 крыс). В условиях заживления экспериментального перелома большеберцовой кости изучали изменения метаболизма в передней большеберцовой и камбалавидной мышце травмированной и контралатеральной конечности. На 7-е сутки эксперимента внутримышечно в зону перелома вводили физиологический раствор.

4 группа. Опытная (20 крыс). В условиях заживления экспериментального перелома большеберцовой кости изучали изменения метаболизма в передней большеберцовой и камбалавидной мышце травмированной и контралатеральной конечности на фоне разового внутримышечного введения низкомолекулярных белковых факторов на физиологическом растворе. Инъекцию осуществляли на 7-е сутки эксперимента.

Эффективность перорального потребления смеси аминокислот (лейцин, изолейцин, аргинин и метионин, в соотношении 1:1:1:1) для коррекции нарушений обмена креатина изучали на взрослых половозрелых мышах-самцах линии СВА (средний вес 25-30г). Животные были разделены на 4 экспериментальные серии.

У животных первой серии (54 животных) моделировали перелом костей голени. Во второй серии – моделировали гипокинезию для мышц задней конечности лишением их опоры в модели «вывешивания» (антиортостатическая гипокинезия, АОСГ) (54 животных), в третьей серии после моделирования перелома костей голени животных лишали опоры в модели АОСГ (54 животных). Внутри каждой серии, в зависимости от пищевого рациона, животные были распределены на три группы. Первый рацион - обычный сбалансированный по белку (3,3г/сутки перевариваемого протеина) и углеводам рацион вивария (приказ № 000 от 10.10.83. «Об утверждении нормативов затрат кормов лабораторных животных в учреждениях здравоохранения»). Второй - изокалорийный углеводный, обедненный белком рацион (0,88г/сутки перевариваемого протеина) (ИКОБР), в котором источником белка служил пшеничный глиадин, неполноценный по содержанию лизина, метионина, треонина; третий – аналогичный второму суточный рацион, в котором недостаток белка восполняли смесью аминокислот L-ряда: лейцин, изолейцин, аргинин, метионин (все аминокислоты высокой очистки фирмы Sigma) в отношении 1:1:1:1, в количестве, равном суммарному содержанию аминного азота в стандартном рационе. Животным четвертой серии (144 животных) моделировали острую печеночную недостаточность (вызывали путем внутрибрюшинного введения 20% раствора четыреххлористого углерода [ЧХУ] на оливковом масле), после чего их делили на три группы, соответственно трем экспериментальным моделям, внутри которых, в зависимости от рациона, мыши были разделены на три подгруппы.

Клинический материал составили пациенты травматологического и ортопедического профиля. Изучали биохимические показатели сыворотки крови 77-и пациентов с закрытыми изолированными переломами костей голени и 29-и – с множественными закрытыми переломами костей конечностей на разных сегментах. Все пациенты травматологического профиля были пролечены с применением аппарата Илизарова по методикам Центра. Ортопедическая патология: изучали показатели сыворотки крови 24-х пациентов больных ахондроплазией, которым проводили удлинение конечностей методом моно-, полилокального и полисегментарного чрескостного дистракционного остеосинтеза и 12 соматически здоровых людей, которым проводили косметическое удлинение конечностей (т. н. субъективно низкий рост).

Для изучения обменных процессов в скелетной мышце, из ткани приготавливали саркоплазматическую вытяжку на 0,03М растворе KCl. У собак исследовали переднюю большеберцовую мышцу (ПББМ) и латеральную головку икроножной мышцы (ИКМ), у крыс вместо икроножной мышцы забирали камбалавидную мышцу (КМ). Миофибриллярные белки выделяли в 0,6М растворе КСl.

В саркоплазматической вытяжке изучали активность следующих ферментов: лактатдегидрогеназы (ЛДГ), креатинкиназы (КК), глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ), каталазы, аланин - (АлАТ) и аспартатаминотрансферазы (АсАТ), кислой фосфатазы (КФ), оценивали суммарную протеолитическую активность. Для ЛДГ определяли изоферментный спектр. В супернатанте находили концентрацию общего белка, продуктов гликолиза – молочной (МК) и пировиноградной (ПВК) кислот. Интенсивность перекисного окисления оценивали по содержанию малонового диальдегида (МДА) и уровню продуктов перекисного окисления белков (ПОБ). Непосредственно в сырой ткани определяли содержание гликогена, общих липидов, креатина и креатинфосфата. В сыворотке крови определяли ферментативную активность ЛДГ, КК, АсАТ, АлАТ, находили концентрацию общего белка, мочевины, креатина, глюкозы, общих липидов, общего холестерина, триглицеридов, МК, ПВК, МДА, продуктов ПОБ. Проводили электрофоретическое разделение сывороточной ЛДГ и КК. В эритроцитах определяли активность супероксиддисмутазы (СОД).

Активность КК, ЛДГ, КФ, АсАТ, АлАТ, а также концентрацию МК, мочевины, креатина, глюкозы, общего холестерина, триглицеридов определяли на биохимическом фотометре Stat Fax® 1904 Plus (США), используя наборы реагентов фирмы Vital Diagnostic (РФ). Каталазную активность в тканевом супернатанте определяли по методу с соавт., активность Г6ФГД по . Общую протеолитическую активность определяли по M. B. Jorgensen, в модификации , протеазную активность выражали в количестве аминокислот, образующихся в ходе реакции, за единицу времени (мг а. к./мин). Активность СОД в эритроцитах определяли по реакции, основанной на способности фермента конкурировать с нитросиним тетразолием (НСТ) за супероксидные анионы. За единицу активности СОД принимали количество фермента, необходимого для 50% ингибирования реакции восстановления НСТ. Активность СОД в эритроцитах выражали в мкмоль НСТ на 109 эритроцитов в минуту. Активность тканевых ферментов рассчитывали на грамм саркоплазматического белка, который определяли по Лоури. Электрофоретическое разделение ЛДГ, КК и саркоплазматических белков проводили на системе Paragon (Beckman, США) с использованием реактивов и пластин этой же фирмы.

В депротеинизированном саркоплазматическом и сывороточном растворе определяли содержание МДА – по реакции с тиобарбитуровой кислотой, концентрацию ПВК – по методу Umbright в модификации Бабаскина, АТФ – при помощи наборов реагентов фирмы «Boehrenger» (Австрия). Содержание креатина в скелетных мышцах находили по реакции с диацетилом, креатинфосфата (КрФ) – по содержанию фосфора в безбелковом тканевом экстракте. Уровень гликогена в мышцах определяли непрямым антроновым методом, в печени – прямым антроновым методом. Содержание общих липидов в мышцах и печени находили гравиметрическим методом, после их экстракции хлороформ/метаноловой смесью (2:1). Общие липиды сыворотки крови определяли с помощью наборов реактивов фирмы La Chema (Чехия). Продукты ПОБ определяли в белковом осадке по реакции с 2,4-динитрофенилгидразином. Продукты реакции регистрировали при длинах волн 270нм (ПОБ270), 363нм и 370нм (ПОБ363+370). Степень окисленной модификации белков выражали в единицах оптической плотности (ед. оп. пл.) на 1 мг белка. Общий белок сыворотки крови определяли с помощью биуретовой реакции. Концентрацию продуктов обмена в мышечном супернатанте выражали в моль на грамм сырой ткани, гликогена в мг на г ткани, общих липидов – в процентах от массы сырой ткани.

Для оценки кинетических характеристик миозина получали его очищенный лиофилизированный препарат. Выделение проводили согласно схеме, основанной на растворимости миозина в растворах солей различной ионной силы, которая сводились к многократному, последовательному осаждению и растворению миозина в растворах хлористого калия разной концентрации. Об активности фермента судили по количеству неорганического фосфата, который образовался при действии миозина на АТФ в присутствии ионов кальция.

Результаты исследования обрабатывали методами непараметрической статистики, поэтому в таблицах и на графиках они представлены в виде медианы, 25-го и 75-го процентиля. Достоверность различий между двумя выборками оценивали с помощью W-критерия Вилкоксона для независимых выборок и критерия знаков. Достоверность межгрупповых различий определяли с помощью непараметрического критерия Крускала-Уоллиса, с последующим множественным сравнением с использованием критерия Данна. Статистический анализ достоверности различий между группами по качественным критериям (т. н. бинарные признаки) проводили с помощью критерия χ2 для таблицы сопряженности 2х2 с поправкой Йейтса. Корреляционную зависимость между выборками, подчиняющихся нормальному распределению, оценивали по критерию Пирсона, не подчиняющихся закону распределения – по критерию Спирмена. Результаты корреляционного анализа представляли в виде коэффициента корреляции с уровнем значимости р≤0,05 и уравнения регрессии. Нормальность выборок определяли с помощью критерия Шапиро-Уилка. Факторный анализ проводили методом главных факторов, метод оценки общностей – анализ главных компонент.

Результаты исследования

Некоторые типологические особенности метаболизма скелетных мышц собак в ходе онтогенеза. Проведенное нами исследование позволило обнаружить некоторые закономерности формирования метаболического профиля скелетных мышц различного типа у собак в ходе онтогенеза. Наибольшие изменения претерпевали процессы энергетического метаболизма скелетных мышц. На фоне изначальных различий в энергообмене ПББМ и ИКМ, с возрастом наблюдалось снижение его интенсивности в обеих мышцах, что приводило к «сглаживанию» их типологических особенностей. Так, в ПББМ активность ЛДГ при рождении была достоверно выше, чем в ИКМ, соотношение ЛДГПББМ/ЛДГИКМ составляло 1,22 (рис. 1). В последующие сроки соотношение активности ЛДГ в изучаемых мышцах изменялась в обратную сторону, и у взрослых животных соотношение ЛДГПББМ/ЛДГИКМ было уже меньше единицы и составляло 0,88. Значительно выше в ИКМ собак при рождении была активность КК – 14,90 мккат/г белка, в ПББМ – 7,66 мккат/г белка (различия значимы при р=0,05). Однако в дальнейшие сроки развития уровень данного фермента в ПББМ и ИКМ снижался и между мышцами достоверно не отличался, составляя у животных 1-3 лет 4,26 и 5,19 мккат/г белка соответственно для ПБММ и ИКМ. Типологические особенности ПББМ также характеризовались более высоким содержанием МК, как при рождении, так у взрослых и старых животных (рис. 1).

ЛДГ, мккат/г белка	Лактат, ммоль/г ткани
Рис. 1. Активность лактатдегидрогеназы и содержание молочной кислоты в скелетных мышцах собак на разных сроках онтогенеза. *- различия между мышцами достоверны при р≤0,05.

Наиболее ярко типологические различия между ПББМ и ИКМ проявлялись в изоферментном спектре ЛДГ. При рождении в спектре ЛДГ в ПББМ, в отличие от спектра взрослых животных, была значительно повышена доля ЛДГ1 и ЛДГ2 фракций, в 5,4 (р=0,01) и в 1,6 (р=0,02) раз соответственно. В ИКМ изоферментный спектр ЛДГ у новорожденных животных практически не отличался от спектра взрослых животных. В течение первых шести месяцев индивидуального развития изоферментный состав ЛДГ в скелетных мышцах собак претерпевал существенные изменения, приближаясь к спектру взрослых животных. Прежде всего в ПББМ снижалась доля аэробных ЛДГ1 и ЛДГ2 фракций, тогда как в ИКМ процентное содержание этих фракций возрастало. В результате таких перестроек у взрослых животных в ПББМ доля ЛДГ1 и ЛДГ2 составляла около 10% от общей активности фермента, доля ЛДГ4 иЛДГ5 – 64%. В ИКМ – 17% и 57% для аэробных и анаэробных фракций соответственно. У животных с выраженными старческими изменениями (более 8 лет) мы наблюдали интересные изменения изоферментного спектра ЛДГ в скелетных мышцах. В ПББМ резко возрастала доля ЛДГ1 и ЛДГ2 фракции, их суммарное содержание составляло около 22% от общей активности, доля анаэробных также оставалась высокой – 60%. Обнаруженные данные демонстрируют, что с развитием старческих изменений в ПББМ собак происходило формирование особого изоэнзимного профиля ЛДГ, характеризующегося высоким содержанием как аэробных, так и анаэробных фракций.

Таблица 1.
Содержание белков саркоплазмы (мг/100мг ткани) в скелетных мышцах собак на разных сроках онтогенеза (Медиана; 25-й÷75-й процентили)
	При рождении	2 месяца	4 месяца	6 месяцев	1-3 года	Более 8 лет
ПББМ	19,30,004 17,5÷21,8	26,40,002 26,3÷28,4	27,80,01 27,2÷28,4	28,20,01 27,1÷28,6	30,0* 29,3÷31,0	28,40,05 27,3÷29,2
ИКМ	18,50,004 16,9÷21,1	26,40,002 25,0÷27,5	29,90,02 28,9÷30,5	29,20,05 28,4÷30,2	32,5 30,2÷33,8	29,00,05 27,1÷30,5

Примечание. ПББМ – передняя большеберцовая мышца, ИКМ – икроножная мышца. Верхний индекс – уровень значимости различий (р) по сравнению со животными 1-3 лет. * - статистическая значимость различий по сравнению с икроножной мышцей при р≤0,05.