Система анализа микробиологических и молекулярно-генетических маркеров для выявления высоковирулентных штаммов Listeria monocytogenes (стр. 2 )

Таблица 1

Биохимические свойства L.monocytogenes, выделенных

на Дальнем Востоке и в Европейской части России

Углевод	Ферментирование углевода L.monocytogenes в зависимости от региона выделения (M ± m, % культур)
Дальний Восток (n=102)	Европейская часть (n=41)	Достоверность различий, р
Мелецитоза	82,4 ± 3,8	56,1 ± 7,7	< 0,05
Арабиноза	25,5 ± 4,3	0	< 0,01
Крахмал	8,8 ± 2,8	0	< 0,05
Глюкоза (в реакции с метиловым красным)	12,7 ± 3,3	68,3 ± 7,3	< 0,01
Глюкоза (в реакции Фогес-Проскауэра)	23,5 ± 4,2	51,2 ± 7,8	< 0,05

Для выявления отличительных особенностей среди L.monocytogenes в зависимости от источника изоляции было выделено 4 группы культур (независимо от региона): 1) от мертворожденных плодов, 2) от мышевидных грызунов, 3) из морских гидробионтов, 4) пищевых продуктов (как контроль) (табл.2).

Таблица 2

Биохимические свойства L.monocytogenes в зависимости

от группы сравнения

Группа сравнения	Ферментирование углевода L.monocytogenes в зависимости от источника выделения (M ± m, % культур)
мелецитоза	сахароза	глюкоза (в реакции с метиловым красным)
Мертворожденные плоды (n=21)	95,2±4,8*	85,7±7,8*	42,9±11,1*
Морские гидробионты (n=16)	81,3±10,1**	56,3±12,8**	18,8±10,1**
Грызуны (n=25)	84,0 ±7,5*	72,0±11,6**	44,0±10,1*
Пищевые продукты (n=59) (контроль)	64,4±6,2	47,5±6,5	16,9±4,9

Примечание: * - р < 0,05; ** - р > 0,05

Выявлено, что чаще разлагали мелецитозу и образовывали ацетилметилкарбинол в реакции с метиловым красным L.monocytogenes в группах «Мертворожденные плоды» и «Грызуны», сахарозу - культуры из группы «Мертворожденные плоды» по сравнению с культурами листерий контрольной группы.

Сравнительный анализ патогенных свойств L.monocytogenes, выделенных на Дальнем Востоке и в Европейской части России. В последние годы достигнут существенный прогресс в изучении различных факторов патогенности листерий. Без учета патогенного потенциала невозможно оценить клинико-эпидемиологическое значение того или иного штамма L.monocytogenes.

С помощью микробиологических методов у культур L.monocytogenes была исследована ферментативная активность, связанная с их патогенностью (табл.3). Не было найдено статистически значимых отличий по ферментативной активности у культур L.monocytogenes, изолированных на Дальнем Востоке и в Европейской части РФ. Выявлены отличия в ферментативной активности (гиалуронидазной, лецитиназной и липазной в отношении к твину 80 и 20) только в зависимости от источника выделения.

Таблица 3

Ферментативная активность, связанная с патогенностью, у L.monocytogenes, изолированных в Дальневосточном регионе и

в Европейской части России

Активность	% обнаружения в зависимости от источника изоляции культуры
Продукты питания (n=50)	Мертворожденные плоды (n=20)	Морские гидроби-онты (n=20)	Грызуны (n=28)
Каталазная	100,0	100,0	100,0	100,0
Гемолитическая	100,0	100,0	100,0	100,0
Гиалуронидазная	92,0 ±3,8	100,0*	60,0±11,2**	100,0*
Лецитиназная	79,5±6,4	100,0**	81,8±8,4*	80,0±7,4*
Липазная в отношении: твин 20 твин 60 твин 80	60,0±9,1	20,0±9,2**	50,0±11,5*	82,1±7,4*
100,0	100,0	100,0	100,0
62,0±8,7	10,0±6,9***	30,0±10,5**	75,0±8,3*

Примечание: * - р > 0,05; ** - р < 0,05; *** - р < 0,01

В экспериментах in vivo изучена вирулентность культур L.monocytogenes на белых неинбредных мышах и морских свинках. По вирулентности для белых мышей культуры L.monocytogenes были чрезвычайно неоднородны. Встречались листериозные культуры как вирулентные, так и слабовирулентные, независимо от источника их выделения. Часть изолятов L.monocytogenes вызывала развитие парезов или параличей у белых мышей, а у морских свинок развивался конъюнктивит, кератоконъюнктивит или кератит, протекавшие с различной длительностью и выраженностью. Нами не установлено связи между вирулентностью штаммов L.monocytogenes, географическим местом и объектом их выделения.

Антибиотикорезистентность культур L.monocytogenes, выделенных в различных регионах России (Дальний Восток и Европейская часть). В процессе адаптации микроорганизма к определенным условиям существования немаловажное значение отводится резистентности к антибиотикам (, 1997). Анализ антибиотикорезистентности изолятов L.monocytogenes с использованием диско-диффузионного метода показал, что изоляты листерий в той или иной степени устойчивы к действию 28 антибактериальных препаратов из 33 использованных. Все культуры L.monocytogenes (100%) оказались резистентными к цефалоспоринам II и III поколения (цефуроксиму и цефтазидиму, цефотаксиму, цефтриаксону, цефаперазону соответственно), налидиксовой кислоте и полимиксину. Высокий уровень резистентности L.monocytogenes был обнаружен к цефалоспорину I (цефалексину) и фторхинолонам (пефлоксацину, ломефлоксацину, ципрофлоксацину).

Все исследуемые культуры листерий обладали полиантибиотикорезистентностью. Отмечено, что наименьший индекс множественной антибиотикорезистентности (МАР) определялся у культур L.monocytogenes, изолированных из пищевых продуктов, особенно из Европейской части РФ (индекс МАР = 0,03 – 0,2) (табл.4).

Наиболее выраженная множественная антибиотикорезистентность отмечалась у культур L.monocytogenes, изолированных из объектов окружающей среды, клинических изолятов, органов животных. В ходе исследований не было отмечено существенных различий в чувствительности к антимикробным препаратам и между культурами, изолированных из клинического материала, органов грызунов, объектов окружающей среды (в том числе из пищевых продуктов), что согласуется с данными других исследователей ( и др., 2002, Troxler R. et al., 2000).

Не выявлено зависимости между антибиотикорезистентностью культур L.monocytogenes и их вирулентностью для животных.

Таблица 4

Антибиотикорезистентность культур L.monocytogenes, выделенных на Дальнем Востоке и в Европейской части РФ из различных источников

Источник	Антибиотикорезистентность культур L.monocytogenes (индекс МАР) в зависимости от региона изоляции
Дальний Восток	Европейская часть РФ
Пищевые продукты	0,14 - 0,62	0,03 – 0,2
Объекты окружающей среды	0,36 – 0,47	не исследовали
Клинический материал	0,24 – 0,54	0,1 – 0,6
Морские гидробионты	0,15 – 0,47	0,27 – 0,45
Грызуны	0,18 – 0,53	0,36 – 0,47

Независимо от источника выделения, все тестируемые культуры L.monocytogenes показали высокую чувствительность к антибактериальным препаратам из групп: пенициллинов (пенициллину, ампициллину, карбенициллину, амоксициллину, амоксиклаву (амоксициллин/клавуланат)), тетрациклинов (доксициклину, тетрациклину), гликопептидов (ванкомицину), а также к гентамицину, цефалоспорину I поколения (цефазолину), рокситромицину, кларитромицину, рифампицину, меропенему, офлоксацину, хлорамфениколу, что также согласуется с данными других исследователей ( и др., 2002, Hof H., 1997, 2004, Safdar A., 2003, Troxler R., 2000).

Таким образом, анализ биологических свойств L.monocytogenes, изолированных в Дальневосточном регионе и Европейской части России из различных источников, показал, что подавляющее большинство культур обладали однотипными свойствами. Свойства штаммов, выделенных на территории Дальнего Востока и в Европейской части России, оказались тождественными свойствам типовых штаммов листерий, что позволяет уверенно рассматривать их как типичные для L.monocytogenes. Наличие отдельных штаммов, имеющих некоторые атипичные свойства (отсутствие способности проявлять β-гемолитическую, лецитиназную активности, ферментировать отдельные углеводы, наличие подвижности при температуре 370С), не меняет общего представления о возбудителе.

Отмеченная вариабельность подвижности, биохимической и ферментативной активности факторов патогенности, антибиотикорезистентности L.monocytogenes указывала на определенную фенотипическую неоднородность природных популяций L.monocytogenes. Важно отметить, что проведенные исследования еще раз показали необходимость учитывать при идентификации культур, предполагаемых как листерии, всю совокупность признаков и свойств, а не совпадение отдельных из них. Правильная идентификация возбудителя приобретает большое значение еще и в связи с тем, что на сегодняшний день именно бактериологическое подтверждение диагноза остается единственно достоверным ( и др., 2002). Однако необходимо подчеркнуть, что полученные результаты не позволили выделить специфические особенности, характерные для штаммов листерий, изолированных из определенных источников, в частности, из клинических изолятов. Поэтому с целью выявления специфических особенностей эпидемически значимых штаммов, мы обратились к молекулярно-генетическим методам исследования.

Генетическая вариабельность штаммов L.monocytogenes, изолированных на Дальнем Востоке и в Европейской части России

В нашей стране до настоящего времени работа по характеристике внутривидовой генетической вариабельности, в том числе факторов патогенности у L.monocytogenes, и определению их связи с источниками изоляции не проводилась. Коллекции культур L. monocytogenes, изолированных на Дальнем Востоке и в Европейской части РФ были проанализированы на присутствие генов, кодирующих интерналины, и другие факторы инвазии (гены actA и aut) с помощью ПЦР.

Не было обнаружено отличительных особенностей встречаемости генов, кодирующих белки-интерналины у штаммов L.monocytogenes, выделенных в различных регионах РФ, но выявлены различия в частоте встречаемости генов, кодирующих отдельные интерналины, в зависимости от источника выделения (табл. 5).

Таблица 5

Встречаемость генов, кодирующих интерналины и другие

факторы инвазии у культур L. monocytogenes (% культур)

Ген	Культуры L.monocytogenes, изолированные от/из
Мертворожденных плодов (n=36)	Органов животных (n=54)	Продуктов питания (n=31)
inlA	100,0	100,0	100,0
inlB	100,0	100,0	96,8
ilnC	100,0	100,0	96,8
inlE	100,0	100,0	96,8
inlF	100,0	72,2	54,8
inlG	40,0	3,7	54,8
inlH	20,0	3,7	29,03
actA	100,0	100,0	100,0
aut	33,3	12,1	51,6

Только ген inlA, кодирующий InlA, был обнаружен у всех исследованных штаммов. Гены inlB, inlC, inlE были выявлены у всех изолятов L. monocytogenes, выделенных из эукариотических организмов, включая человека. Штаммы L. monocytogenes, у которых данные гены не выявлялись методом ПЦР, встречались только среди изолятов из продуктов питания.